基于生物信息学的突变诱导及对嗜热脂肪地芽孢杆菌ATCC 7953来源的GDSL脂肪酶GstLipC的生化特性分析

《International Journal of Biological Macromolecules》：Bioinformatics-guided mutagenesis and biochemical characterization of the GDSL lipase GstLipC from Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953

　　

摘要

GDSL脂肪酶属于SGNH水解酶超家族，具有广泛的底物特异性和催化适应性，因此是研究高温条件下结构与功能关系的理想模型酶。尽管具备这些特性，但影响嗜热GDSL脂肪酶催化性能的残基级因素仍缺乏充分研究。在本研究中，我们结合计算机模拟策略与实验分析方法，研究了合理设计的氨基酸替换对一种嗜热GDSL脂肪酶催化特性的影响。首先将来自Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953的GstLipC基因克隆到pET28a(+)载体中，根据结构建模和分子对接分析引入了四个点突变（I184H、I184V、R196L和R196F）。随后表达并纯化野生型及突变型酶，对其开展生物化学和动力学分析。结果表明，GstLipC、GstLipC_I184V和GstLipC_R196F在90℃时活性最高，而GstLipC_I184H在100℃时活性最佳；GstLipC_R196L在这两种温度下的活性相近。所有突变体在pH 8条件下均表现出最佳活性，且热稳定性较高。在0.1 mM Triton? X-100存在下，突变型酶的Km值低于野生型，说明其底物结合方式发生了变化，其中GstLipC_R196F的Km值最低。总体而言，本研究表明通过残基级工程改造可调控嗜热GDSL脂肪酶的催化性能和热行为，为理解耐热酶的结构与功能关系提供了依据。

引言

由于具有较高的催化效率和多样的功能特性，脂肪酶被广泛应用于洗涤剂、食品、乳制品、纸浆以及制药行业。其工业价值主要源于底物特异性、在有机溶剂中的稳定性以及较强的区域选择性等特征[1]。脂肪酶与酯酶（EC 3.1.1.1）功能相关，属于甘油酯水解酶（EC 3.1.1.3），能够催化三酰甘油水解为游离脂肪酸和甘油[2]。

脂肪酶存在于动物、植物和微生物中，这类酶大多含有N端信号肽和丝氨酸类活性位点。根据保守的催化结构 motif，它们通常被分为两大类：GXSXG型和GDSL型[3]。GXSXG型脂肪酶采用经典的Ser-His-Asp/Glu催化三联体，其中丝氨酸位于β链与α螺旋交界处的保守Gly/Ala–X–Ser–X–Gly结构中[4]；而GDSL型脂肪酶则在其N端附近具有保守的Gly-Asp-Ser-(Leu)[GDSL]结构 motif，因此具有广泛的底物特异性，能够水解多种酯类物质，包括含硫化合物、芳酸、脂质以及氨基酸衍生物[4]。由于其水解灵活性和高稳定性，这类酶有望在食品、化妆品、制药及清洁行业得到应用。

近年来，越来越多的研究聚焦于微生物来源的GDSL脂肪酶，尤其是来自嗜热细菌的此类酶，旨在提升它们的结构和功能特性。定向进化、定点突变等蛋白质工程方法已被成功用于提高酶的耐热性、溶剂耐受性以及催化效率[3]。其中，Geobacillus属细菌产生的脂肪酶因天然适应高温环境而备受关注，是极具潜力的工业生物催化剂[5]、[6]。不过，许多GDSL脂肪酶仍缺乏足够的研究，尤其是在其结构与功能关系以及极端操作条件下的表现方面。

通过定点突变进行蛋白质工程改造是提升脂肪酶催化性能的有效手段。即使是单一氨基酸的替换，也能通过改变活性位点结构、底物结合能力或蛋白质的灵活性，显著影响酶的活性[6]。这类突变可提高酶的耐热性、降低底物抑制效应或拓宽底物特异性，从而使酶能够适应那些通常需要高温、碱性环境或有机溶剂存在的工业应用条件[7]。尤其对于阐明GDSL脂肪酶的结构与功能关系而言，突变研究具有重要意义，因为目前关于其底物识别、催化效率及稳定性的分子决定因素的研究程度，还远不及传统脂肪酶[3]、[8]。基于生物信息学和结构建模设计的合理突变，不仅有助于深入理解酶的催化机制，还能培育出具有更高生物技术应用价值的酶变体[5]、[9]。

基于上述背景，本研究针对Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953产生的GDSL型脂肪酶（GstLipC），开展了克隆、表达及生物化学特性分析工作。通过同源建模和分子对接等结构导向分析，筛选出了预测的底物结合区域附近的残基作为目标突变位点，进而引入了四个点突变（I184H、I184V、R196L和R196F），以研究这些突变对酶活性、热稳定性及动力学特性的影响。野生型及突变型酶均在Escherichia coli BL21 (DE3) Star细胞中异源表达，经纯化后在不同温度和pH条件下进行了测试。本研究旨在探讨靶向残基替换是否能够调节GstLipC的催化效率与热稳定性，从而为序列变异与酶功能之间的关系提供理论依据。

章节要点

化学品与试剂

p-硝基苯棕榈酸酯（pNPC16）购自Sigma-Aldrich（美国）。Wizard基因组DNA提取试剂盒、质粒DNA分离试剂盒、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶以及脱氧核苷三磷酸均来自Promega（美国威斯康星州麦迪逊市）。Q5?高保真DNA聚合酶（产品编号：M0491S）购自NEB公司，T4 DNA连接酶来自Thermo Scientific公司（批次号：0084053），CloneJET PCR克隆试剂盒亦来自Thermo Scientific公司，编号为2694226，Phusion高保真DNA聚合酶同样来自Thermo Scientific公司。

GstLipC的生物信息学分析

来自Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953的GDSL家族脂肪酶GstLipC的氨基酸序列（NCBI AD编号：GAA5659837.1）是从NCBI数据库中获取的。编码该脂肪酶的基因片段位于该菌的基因组中（JGI基因编号：2610902186）。通过聚合酶链反应扩增出了包含gstLipC基因的771 bp片段，其DNA序列通过Sanger测序进行了验证。通过对扩增得到的基因序列进行分析，得出了相应的氨基酸序列。

结论

在本研究中，通过生物信息学分析合理设计了来自Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953的GDSL脂肪酶（GstLipC）的点突变版本，随后对这些突变体进行了克隆、表达及生物化学特性分析。所有酶株，包括野生型及各种突变型，在高温条件下仍保持较高的催化活性和良好的热稳定性，这证明了它们在工业应用环境中的适用性。在I184位点引入的突变

CRediT作者贡献说明

Arife Ka?iran：论文撰写——初稿撰写、结果验证、方法设计、实验研究、数据分析、数据整理。Suleyman Hekim：结果验证、方法设计、数据整理。Miray ?ahinkaya：实验研究、数据分析、数据整理。Ay?e Nur Akmehmet：方法设计、实验研究、数据整理。Sabriye Canakci：论文撰写——审阅与编辑、项目管理。Kadriye ?nan Bekta?：项目管理、数据整理。Ali Osman Belduz：论文撰写——审阅与编辑、研究指导、项目整体协调。

资金支持信息

本研究得到了土耳其科学技术研究委员会（TüBITAK）在2244——工业博士项目下的资助，同时也有Eryigit Medical Devices Inc.和卡雷德尼兹技术大学的支持（项目编号：119C076）。

利益冲突声明

作者声明存在以下可能被视为利益冲突的财务利益或个人关系：Ali Osman BELDUZ表示其研究工作得到了卡雷德尼兹技术大学的资金支持。其他作者则声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

Arife Ka?iran|Suleyman Hekim|Miray ?ahinkaya|Ay?e Nur Akmehmet|Sabriye Canakci|Kadriye ?nan Bekta?|Ali Osman Belduz