靶向转甲状腺素蛋白四聚体（transthyretin tetramer, TTR tetramer）的新型血脑屏障穿透小分子稳定剂用于治疗阿尔茨海默病

《International Journal of Biological Macromolecules》：Targeting transthyretin tetramer with a novel blood-brain barrier-penetrating small-molecule stabilizer for the treatment of Alzheimer's disease

　　

转甲状腺素蛋白（transthyretin, TTR）四聚体的稳定性对调控阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）中脑内淀粉样蛋白-β（amyloid-β, Aβ）稳态至关重要。稳定的TTR四聚体可直接结合Aβ并促进其从脑内清除。然而，现有TTR四聚体稳定剂缺乏血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）穿透能力，限制了其临床转化。为充分实现TTR在AD中的治疗潜力，必须发现具有优异BBB穿透能力的新型TTR四聚体稳定剂。研究人员通过多维虚拟筛选工作流鉴定具有BBB穿透能力的TTR四聚体稳定剂，并对其生物活性进行初步验证。最终确定Z1097086893为先导化合物。体外实验中，该化合物表现出显著的BBB穿透能力和强效TTR四聚体稳定活性。体内实验中，Z1097086893亦可跨BBB分布，质谱成像（mass spectrometry imaging, MSI）显示其定位于脑室系统内脉络丛（choroid plexus）——脑内TTR合成与分泌的主要部位。在5xFAD小鼠模型中，该化合物显著降低海马Aβ斑块负荷，减轻神经元损伤，并挽救空间学习与识别记忆缺陷。安全性评估证实Z1097086893在治疗剂量下耐受性良好，未检测到药物诱导的器官毒性或肝肾功能异常。上述发现验证了脑内TTR四聚体稳定作为AD极具前景的治疗策略，并为进一步临床转化提供先导化合物。此外，本研究建立的BBB优先筛选工作流为AD脑靶向治疗药物开发提供了可推广的技术框架。

研究背景与立题依据

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是最常见的神经退行性疾病，其核心病理包括细胞外淀粉样蛋白-β（amyloid-β, Aβ）聚集形成斑块、tau蛋白过度磷酸化、进行性神经元丢失及血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）功能障碍。Aβ积累被视为致病起始事件。转甲状腺素蛋白（transthyretin, TTR）是由肝脏与脉络丛合成的55 kDa同源四聚体蛋白，其天然四聚体可直接结合Aβ、抑制其聚集并促进清除；AD患者脑内TTR四聚体稳定性下降，削弱神经保护功能。目前已获批的TTR四聚体稳定剂他法米迪斯（tafamidis）用于转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR），但因研发时未考虑中枢递送，生理条件下脑暴露极低，无法有效稳定脑内TTR四聚体。全球尚无具备高效BBB穿透的TTR稳定剂进入AD临床。因此，发现同时具备BBB穿透与TTR四聚体稳定活性的小分子，是亟待解决的核心问题。研究人员以"稳定脑内TTR四聚体"为主目标，建立BBB优先的高通量虚拟筛选（high-throughput virtual screening, HTVS）工作流，旨在获得可转化的AD治疗先导化合物，相关成果发表于《International Journal of Biological Macromolecules》。

主要关键技术方法

研究人员从TopScience数据库约1200万分子中，依次采用ADMET（吸收、分布、代谢、排泄与毒性）性质预测过滤口服吸收、BBB穿透、CYP2D6抑制与肝毒性；基于BindingDB中30个实验验证分子用HypoGen算法构建3D-QSAR药效团模型（优选Hypo1）；选用PDB 1Y1D晶体结构配合Glide XP对接协议对候选库 docking 筛选；体外以hCMEC/D3细胞Transwell单分子层（TEER约33–34 Ω·cm²）评价BBB穿透，尿素诱导解离结合Bis-Tris电泳评价TTR四聚体稳定；体内样本包括健康人血浆、野生型与5xFAD转基因小鼠（3月龄雄性，每组5只，腹腔注射20 mg/kg Z1097086893每周3次共3个月），用LC-QQQ-MS定量脑浓度、MALDI-MSI定位脉络丛、Western blot检脑TTR四聚体、免疫荧光与H&E/Nissl染色评海马病理、新物体识别与Morris水迷宫评认知；辅以200 ns分子动力学（MD）模拟、MM-GBSA自由能计算及Gaussian 16 DFT（B3LYP-D3/6-311G^**，M06-2×/def2-TZVP）分析电子特征。

研究结果

3.1 高通量虚拟筛选鉴定兼具BBB穿透与TTR四聚体稳定活性的命中化合物

经ADMET过滤保留128,946分子，Hypo1药效团（含2芳香环+1氢键受体）筛得10,433候选，1Y1D-XP对接（AUC=0.8442）取前1%并结合界面结合、残基互作、形状互补与商业可得性，购得9个命中物。PyMOL显示均与TTR四聚体二聚体-二聚体界面Lys15/Leu17/Ala108/Leu110形成稳定氢键，模式与他法米迪斯一致。

3.2 命中化合物在体外展现BBB穿透与TTR四聚体稳定活性

hCMEC/D3单分子层（TEER≈33–34 Ω·cm²）中9个命中物50 μM下细胞活力>80%，穿透率均>10%，其中STK505685、STK511733、Z335441748、Z1097086893>15%。尿素变性实验以他法米迪斯IC₅₀=2.002 μM为基准，STK505685（2.669 μM）、STK511733（13.50 μM）、Z1097086893（9.057 μM）具浓度依赖稳定效应，Z335441748无效被排除。

3.3 分子动力学模拟阐明命中物稳定TTR四聚体机制

200 ns MD显示配体-TTR复合体骨架RMSD<2 ?，Lys15/Leu17/Ala108/Leu110残基RMSF下降、Rg降低、SASA小于apo-TTR；Z1097086893氢键数由1增至2，MM-GBSA结合自由能优于或持平他法米迪斯，范德华与极性溶剂化能为驱动主因。

3.4 命中化合物具与TTR口袋互补的保守电子特征

FMO分析HOMO-LUMO能隙（ΔE）排序与体外活性不完全对应；MEP面显示电子富集区与TTR Lys15侧链缺电子区空间互补，支撑氢键与极化作用。

3.5 Z1097086893在小鼠体内展现优异BBB穿透

尾静脉5 mg/kg后1 h，MALDI-MSI示Z1097086893特异富集于侧脑室脉络丛，LC-QQQ-MS定量脑浓度显著高于STK505685、STK511733与他法米迪斯，选为唯一先导化合物。

3.6 Z1097086893直接结合TTR且不干扰其生理互作

ANS竞争位移IC₅₀=9261 nM证实直接结合；ThT实验示其不直接抑制Aβ_1–42聚集或增强TTR抑聚作用；native PAGE-RBP4免疫印迹示10–1000 μM不改变TTR-RBP4复合体分布。

3.7 Z1097086893改善5xFAD小鼠认知缺陷并减轻Aβ病理损伤

NOR测试给药组辨别指数回升至野生型水平（新奇物探索~70%）；MWM训练逃逸潜伏期随天数缩短、探针期靶象限停留>30%（野生型相近，模型组~20%），游泳速度无差异。Westem blot示脑TTR四聚体丰度显著升高（P<0.01）；H&E与Nissl示海马存活神经元增加；Aβ_1–42免疫荧光斑块密度显著下降；PSD-95上升、Iba-1与GFAP下降，提示突触完整性改善与神经炎症减弱。

3.8 Z1097086893在5xFAD小鼠中系统安全性良好

3个月给药后血清ALT、AST、BUN、CREA与对照组无差异；心肝脾肺肾H&E未见坏死、浸润或结构破坏。

讨论与结论翻译

讨论指出，本研究首次将BBB穿透作为TTR稳定剂筛选的首要门槛，而非沿用外周ATTR药物再定位思路，解决了脑内有效浓度不可及的根本瓶颈。Z1097086893在脉络丛的定位与TTR内源合成位点为同一解剖区域，提示其可能通过稳定局部新合成TTR四聚体而促进Aβ清除。虚拟筛选中ADMET→药效团→对接的三级过滤大幅压缩搜索空间，工作流可推广至其他脑靶向大分子相互作用调节剂开发。

结论：研究人员发现小分子Z1097086893兼具BBB穿透与TTR四聚体稳定双重属性，在5xFAD模型中通过提升脑内TTR四聚体稳定性降低Aβ斑块、挽救神经元与认知缺陷，治疗剂量下无肝肾毒性及器官病理改变，从而验证"脑内TTR四聚体稳定"是AD的可靠干预路径，并为临床前候选药物提供明确先导结构与技术范式。