人类肠道微生物群中芳香族氨基酸代谢组的分析揭示了艰难梭菌特异性的N-酰基氨基酸

《mSystems》：Profiling the aromatic amino acid metabolome in the human gut microbiota reveals Clostridioides difficile-specific N-acyl amino acids

　　

由于肠道微生物群代谢组在组成和化学复杂性上的特点，其大部分仍未被充分表征。芳香族氨基酸（Aromatic amino acids, AAAs）历来是多种生物活性代谢物生物合成的优先底物，因此代表了微生物群代谢组中潜在丰富的生物活性分子来源。在本研究中，研究人员利用¹³C-和²H标记的芳香族氨基酸和非靶向液相色谱-质谱联用（Liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）技术，对80种系统发育多样的人类肠道细菌分离株产生的AAA衍生代谢物进行了分析。研究人员总共发现了93个独特的LC-MS特征，其中大多数主要由艰难梭菌（Clostridioides difficile）产生，并被鉴定为N-酰基氨基酸（N-acyl amino acids）。艰难梭菌产生的AAA衍生苯乙酸和苯丙酸水平最高，超过了本研究中所有拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）菌株。艰难梭菌独特多样的N-酰基氨基酸有潜力作为艰难梭菌定植的生物标志物以及艰难梭菌特异性宿主相互作用的介导物。重要性：细菌代谢组是微生物群影响宿主生理的关键组成部分，但识别可能驱动这种相互作用的小分子仍然是一个挑战。本研究使用高通量和定量质谱代谢组学表明，艰难梭菌独特地将氨基酸转化为至少28种N-酰基氨基酸，这是一个历史上与多种生物活性相关的代谢物家族。此外，在艰难梭菌培养物中，高水平的苯乙酸（6种N-酰基氨基酸的前体）值得关注，因为先前的研究已通过β₂-肾上腺素能受体（β₂AR）信号通路将微生物产生的苯乙酸与心血管疾病机制性地联系起来。鉴定共生细菌产生的物种特异性代谢物不仅提供了可作为定植敏感生物标志物的化合物，还有助于支持关于单个物种如何影响其宿主的机制性假说的提出。

肠道微生物群代谢组是宿主-微生物相互作用的关键介质，但因其组成和化学复杂性，大部分仍未被充分表征。芳香族氨基酸（Aromatic amino acids, AAAs）是多种生物活性代谢物的优先前体，但在肠道微生物群中，AAA衍生代谢物的多样性及其物种特异性尚不清楚。现有研究缺乏对肠道细菌产生AAA代谢物的系统筛选，尤其是难以鉴定潜在的生物活性分子和物种特异性标志物。为填补这一空白，研究人员利用稳定同位素标记和非靶向液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术，对80种系统发育多样的人类肠道细菌分离株的AAA代谢组进行了系统性分析。研究发现，艰难梭菌（Clostridioides difficile）是产生最多AAA衍生代谢物的菌种，其独特产生28种N-酰基氨基酸（N-acyl amino acids），并作为苯乙酸（Phenylacetic acid, PAA）和苯丙酸（Phenylpropionic acid, PPA）的最高生产者。这些发现为艰难梭菌定植提供了敏感生物标志物，并提出了物种特异性宿主相互作用的机制假说。该研究强调了稳定同位素示踪在发现新代谢物和生成可检验假说中的价值，论文发表在《mSystems》。

研究人员采用的关键技术方法包括：使用¹³C和²H标记的苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸进行稳定同位素示踪；结合非靶向液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行高分辨率代谢组学分析；利用MetExtract II软件提取同位素标记特征，并通过分子网络分析（Global Natural Products Social Molecular Networking, GNPS）进行结构相似性分析；通过合成标准品（如异己酰基和苯乙酰基衍生物）进行保留时间和质谱比对，实现代谢物的水平1鉴定；对苯乙酸和苯丙酸进行绝对定量。样本来源于80种人类肠道细菌分离株，涵盖拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）等主要门类，购自生物防御和新发感染研究资源库（Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository, BEI Resources）。

**肠道微生物群的芳香族氨基酸代谢组**：研究人员通过同位素标记和LC-MS筛选，在80种细菌中鉴定出47个苯丙氨酸标记、35个色氨酸标记和11个酪氨酸标记的代谢物特征，共计93个独特特征。这些特征在菌株间的分布呈现种属特异性，大部分已知代谢物（如色胺、苯乙酸）仅由少数菌种产生，表明代谢途径具有物种特异性。多数未注释特征与已知代谢物具有相似的表达模式，提示共享生物合成途径。

**艰难梭菌特异性的N-酰基氨基酸来源于AAAs**：通过分子网络分析，研究人员发现艰难梭菌产生的31个特征中，30个聚集于两个网络，其中26个经质谱比对与中链饱和N-酰基氨基酸匹配。利用合成标准品，确认了异己酰色氨酸（iCTrp）、异己酰苯丙氨酸（iCPhe）和异己酰酪氨酸（iCTyr）为水平1鉴定。此外，还鉴定出13个脂链长度为C2:0至C7:0的N-酰基氨基酸，以及苯乙酰苯丙氨酸（PAPhe）、苯乙酰色氨酸（PATrp）和苯乙酰酪氨酸（PATyr）等苯乙酰基衍生物，后者经同位素标记和合成标准品确认。

**艰难梭菌产生多样的N-酰基氨基酸**：研究人员系统搜索了所有常见氨基酸与异己酸或苯乙酸的缩合产物，发现异己酰组氨酸（iCHis）、异己酰赖氨酸（iCLys）、异己酰精氨酸（iCArg）、苯乙酰甲硫氨酸（PAMet）、苯乙酰赖氨酸（PALys）和苯乙酰精氨酸（PAArg），并通过合成标准品进行水平1鉴定。这些结果揭示了艰难梭菌产生N-酰基氨基酸的多样性，涉及多种氨基酸底物。

**在肠道微生物群中，艰难梭菌产生最高水平的苯乙酸和苯丙酸**：通过绝对定量，研究人员在5株艰难梭菌培养物中均检测到超过100 μM的²H₅-PAA和²H₅-PPA，且苯丙氨酸几乎被完全消耗。在所有筛选的80种细菌中，艰难梭菌是PAA的最高生产者，其产量比拟杆菌门最高产菌株Bacteroides sp. 3_1_19高出3.6倍，且是唯一消耗超过30%¹³C-苯丙氨酸的菌种。对于PPA，艰难梭菌产量比唯一其他生产者C. cadaveris高出25倍。

讨论部分指出，艰难梭菌通过Stickland代谢将氨基酸转化为中链脂肪酸（如异己酸和苯乙酸），进而与氨基酸缩合形成N-酰基氨基酸。这些物种特异性代谢物可作为艰难梭菌定植的生物标志物，并且苯乙酸衍生物可能与宿主β₂-肾上腺素能受体（β₂AR）信号通路相关，类似于苯乙酰谷氨酰胺（PAGln）的作用机制。研究结论：鉴定共生细菌产生的物种特异性代谢物不仅提供了可作为定植敏感生物标志物的化合物，还有助于支持关于单个物种如何影响其宿主的机制性假说的提出。