放线菌门中c-di-GMP调控的σ因子调控分化与功能多样化

《mSystems》：Regulatory divergence and functional diversification of a c-di-GMP-controlled sigma factor in Actinomycetota

　　

σ28家族替代σ因子的成员通常调控鞭毛生物合成相关基因。然而，放线菌纲链霉菌属中唯一的σ28家族成员WhiG调控气生菌丝向孢子的分化。WhiG活性受第二信使c-di-GMP调控，c-di-GMP促使与其同源的反σ因子RsiG结合并隔离该σ因子。理解WhiG进化可阐明c-di-GMP在放线菌门（Actinomycetota）各谱系中调控过程的多样性。放线菌门包含高度多样的丝状与单细胞、有鞭毛与无鞭毛物种，其祖先预测为运动型。研究人员系统分析发现，WhiG同源蛋白广泛分布于放线菌门并形成两支：WhiG1保留与鞭毛生物合成基因簇的祖先关联且不受RsiG反σ因子调控；WhiG2通常通过RsiG经c-di-GMP调控。这凸显了该关键转录因子在全门中的系统发育分裂。WhiG靶调控子（regulon）生物信息学分析表明，该σ因子功能显著多样化，在多样放线菌种中调控运动性、趋化性、IV型菌毛合成、产孢、抗生素生物合成及c-di-GMP代谢等过程。

该研究背景源于σ²⁸家族替代σ因子在细菌中多负责鞭毛生物合成调控，而放线菌门链霉菌属特有成员WhiG却专司气生菌丝产孢分化，其活性由第二信使c-di-GMP通过反σ因子RsiG（anti-σ RsiG）以c-di-GMP二聚体桥接方式抑制。尽管研究人员此前已在链霉菌与Rubrobacter中证实该调控模式，但WhiG同源蛋白在放线菌门全门的系统发育分布、是否被RsiG普遍调控、以及其功能是否多样化仍不清楚。为回答这些问题，研究人员在《mSystems》发表工作，对673株放线菌门代表基因组开展系统分析。

关键技术方法包括：基于37个保守看家基因串联比对构建673基因组最大似然系统发育树；以S. venezuelae WhiG为查询进行BLAST筛选同源序列并构建WhiG专用系统发育树；利用AlphaFold3预测RsiG与WhiG1/WhiG2互作复合物并以细菌腺苷酸环化酶双杂交（BACTH）验证；采用cblaster定位鞭毛基因簇；基于WhiG共识启动子（?35 XT(C/A)AX；?10 GCCGA）扫描预测调控子，并用EFI-EST构建序列相似网络（sequence similarity network, SSN）；在S. venezuelae ΔwhiG背景下异源过表达G. obscurus whiG1/whiG2观察表型互补。样本队列为GenBank中673个放线菌门参考/代表基因组及10个Chloroflexota外类群。

研究结果如下。

放线菌WhiG同源蛋白形成两个明显亚支：从673基因组中鉴定248个WhiG同源（187基因组含至少1个），最大似然树显示早期分叉为WhiG1（96序列）与WhiG2（152序列，含S. venezuelae WhiG）。

RsiG与WhiG2而非WhiG1形成复合物：Mantel检验显示WhiG2与RsiG共存极显著相关（r=0.88, P=0.001），WhiG1不相关。AlphaFold3中RsiG_Go–WhiG2_Go ipTM=0.86，RsiG_Go–WhiG1_Go ipTM=0.14；BACTH体内验证一致。序列标志分析显示WhiG2保守Lys57/Gly61/Arg62（σ₂域c-di-GMP接触残基）及Thr235/Leu236/Glu240/Leu242（σ₄域RsiG接触残基），WhiG1这些位点变异。

WhiG1与鞭毛生物合成基因簇共分布：12%基因组含鞭毛簇，81%含鞭毛簇基因组同时含WhiG1（r=0.84, P=0.001），62% WhiG1编码于簇内或邻侧5基因内；WhiG2仅46%共现。

WhiG1与WhiG2识别相似启动子：在S. venezuelae ΔwhiG中过表达whiG1_Go或whiG2_Go均复现原生whiG过表达的高产孢表型，DNA接触关键残基在两支均保守，表明启动子识别未分化。

放线菌WhiG同源调控子生物信息学预测：在WhiG高保守属中扫描启动子得7199匹配，SSN分131簇。已知S. venezuelae靶whiI、whiH落入大簇；跨科保守大簇含趋化（cluster 2/11/20/52）、鞭毛（flagellin、FlbD）、IV型菌毛（cluster 23/28）、c-di-GMP代谢酶DGC/PDE（cluster 1/4/13/25/32/44/118，涉8科307基因）、转录调控因子（WhiI、WhiH、BldM、WhiB样、LacI、TetR、AfsR等）及专化代谢产物合成（NRPS/PKS，cluster 60）。链霉菌科内whiI靶占97%、whiH占67%。

讨论部分总结：放线菌门WhiG祖先复制后分化为WhiG1（保留鞭毛关联、无RsiG调控、FlgM缺失暗示未知反σ机制）与WhiG2（经c-di-GMP-RsiG调控）。调控子功能跨分类层级多样，c-di-GMP代谢DGC/PDE为最广泛靶类，提示反馈环路；与另一c-di-GMP依赖转录因子BldD在链霉菌中时序互补（营养期BldD抑DGC，产孢期WhiG2激活）。WhiG1在Actinoplanes多旁系仅部分重叠，同株共存的WhiG1/WhiG2受不同输入信号。BldM在链霉菌外作为WhiG靶出现，体现转录网络重连。

研究结论翻译：尽管σ²⁸家族在细菌中广布，目前已知唯一直接受c-di-GMP调控的鞭毛相关σ因子即放线菌门WhiG。本研究据系统发育将放线菌WhiG分为两支：WhiG1不能结合RsiG、保留与鞭毛簇祖先关联；WhiG2（含全部链霉菌同源）多由RsiG经c-di-GMP调控。该二分支持放线菌门早期复制后调控机制分化。WhiG1反σ伙伴未明，FlgM在放线菌鞭毛簇中几乎缺失，暗示晚期鞭毛合成另有机制。调控子预测显示功能显著多样化，c-di-GMP代谢酶为最普适靶类，运动、趋化、IV型菌毛、产孢、专化代谢均被覆盖，证明c-di-GMP通过WhiG2（及部分WhiG1）在放线菌门多层调控形态与行为。