在本研究中,研究人员在严格的厌氧条件下,从奶牛犊(动物伦理审批号IUCAC # 807522)的粪便中分离出了
F. prausnitzii。所使用的培养基为经过改良的YCFA培养基(含有酵母提取物、Casitone以及脂肪酸),并添加了0.25%的果糖和0.25%的蔗糖,同时还加入了30%的经高压灭菌处理的奶牛瘤胃液,具体培养条件与先前描述的一致(
5)。研究人员将从3周大的荷斯坦牛犊身上收集的约2克新鲜粪便悬浮在10毫升的厌氧稀释液中(该稀释液在二氧化碳环境下制备,然后倒入Hungate管中并密封),形成悬浮液后进行离心处理(5000转/分钟,1分钟)。然后将上清液(0.1毫升)依次稀释至10
?10浓度,接种到YCFA琼脂管中,随后将琼脂管翻转并在37°C下培养24小时。从10
?7至10
?9稀释度的琼脂管中挑取单个菌落,转移到液体培养基中继续培养。重复这一过程,直至获得纯化的细菌培养物。通过显微镜观察确认菌落形态一致后,便使用RBB + C方法提取纯化培养物的基因组DNA,并利用引物F27(5′-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和R338(5′-
TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′)通过PCR扩增16S rRNA基因的V1–V2区域,具体操作方法参照Pitta等人的研究(
6)。对16S rRNA基因进行的Sanger测序结果显示,该菌与
F. prausnitzii菌株
NR_028961.1的序列相似度为99.13%。此外,还使用Illumina HiSeq平台对该菌的基因组DNA进行了全基因组测序(测序深度为2 × 150 bp)。使用SPAdes v3.15.5软件(
7)以及Pilon v1.24软件(
8),在默认参数设置下对测序得到的7,558,889条高质量读段进行了从头组装,之后又对组装结果进行了优化处理。组装统计分析使用QUAST v5.3.0软件完成(
9);基因组质量评估则使用CheckM v1.2.3软件进行(
10);分类鉴定工作通过GTDB-Tk软件完成(
11);基因注释则使用Bakta v1.12软件完成(
12);而抗菌素耐药基因的检测则通过AMRFinderPlus v4.0.13软件实现(
13)。
该菌的基因组草案由48个连续片段组成,总长度为3.01 Mb,N50值为138,331 bp,GC含量为56.53%,基因组完整性为100%,未检测到污染,序列覆盖度约为700倍。GTDB-Tk软件将该分离菌鉴定为
F. prausnitzii,其与参考基因组
GCF_003324185.1的核苷酸平均相似度为99.99%。基因组注释结果显示,该菌含有2,751个编码序列,其中包括1个CRISPR阵列、3个rRNA基因、52个tRNA以及35个非编码RNA区域,且未检测到抗菌素耐药基因。