从手工制作的奶酪中分离出的乳酸肠球菌SP-50a的基因组序列草图，该菌具有生产抗菌剂和生物聚合物的潜力

《Microbiology Resource Announcements》：Draft genome sequence of Enterococcus lactis SP-50a, isolated from artisanal cheese, with potential to produce antimicrobial agents and biopolymers

　　

摘要

手工制作的奶酪是具有生物技术潜力的细菌的来源。Enterococcus lactis SP-50a的基因组大小为2.71 Mb，包含2,637个基因。分析发现其中存在与抗菌活性相关的细菌素和肽聚糖水解酶合成基因。此外，还检测到了fabG基因，这表明该菌可能具有生产聚羟基烷酸的能力。

公告

Enterococcus lactis有望为解决抗菌药物耐药性（1）和塑料污染问题（2）提供双重生物技术解决方案。这一属的细菌能够合成多种抗菌物质，包括细菌素（3）和肽聚糖水解酶（4），同时还可能具备生物聚合物合成的代谢途径（5，6）。

SP-50a菌株是从韦拉克鲁斯州拉霍亚市的当地农场奶酪样本中分离得到的，相关研究此前已有报道（7）。这些细菌在De Man、Rogosa和Sharpe（MRS）培养基中于37°C下培养12小时，且不进行搅拌（OD_600nm：0.771 ± 0.02）。初步分析显示，该菌与Enterococcus faecium DSM 20477的相似度为99.87%（ID：99.87%，NR_114742）。不过，16S测序并不足以区分E. faecium和E. lactis（8）。为了确定物种归属以及开展生物技术应用，研究人员对该菌进行了全基因组测序。基因组DNA是用Allprep Bacterial/DNA/RNA/Protein Kit（QIAGEN，产品编号47054）提取的。通过BioTek Epoch 2微板分光光度计对DNA纯度进行了检测（A₂₆₀/A₂₈₀：1.97；浓度：219 ng/μL）。还通过1%琼脂糖凝胶电泳检测了DNA的完整性，确认其中存在高分子量的基因组物质。库的制备是按照制造商的说明，使用Rapid Sequencing Kit v14（SQK-RAD114）完成的。简而言之，先将100–150 ng的基因组DNA用无核酸酶的水稀释至10 μL的体积。随后通过转座酶法结合片段化试剂盒实现酶促片段化及适配器连接。反应在30°C下孵育2分钟，然后加热到80°C再孵育2分钟以使酶失活，之后立即将反应液放在冰上冷却。最后向片段化的DNA中加入1 μL的快速适配器，在室温下孵育5分钟。测序是用Dorado V1.4软件（https://github.com/nanoporetech/dorado）以及dna_r10.4.1_e8.2_400bps_sup@v4.3.0模型进行的。筛选出的读段要求Q值至少为10，长度至少为200 bp。该菌的de novo基因组是使用Flye v2.9.4软件（9）组装的，随后又用Medaka v2.2.1软件（https://github.com/nanoporetech/medaka）进行了优化。除非另有说明，这两个工具都是使用默认参数运行的。SP-50a菌株的基因组组装结果为两个连续序列，总长度为2,715,204个碱基对：一条2.54 Mb的细菌染色体（覆盖度：153×），以及一条172 kb的质粒（覆盖度：151×）。该基因组是使用NCBI原核生物基因组注释流程（PGAP）v.6.10进行注释的。基因组组装和注释的相关数据见表1。分类学身份是通过FastANI v1.34工具确认的（10），该菌与E. lactis SU-B46菌株的核苷酸平均相似度为99.26%（GCA_030490365.1）。研究还发现了多个与细菌素生物合成相关的基因，包括细菌素免疫蛋白（MHN6393358.1）和II类细菌素基因（MHN6393359.1）。此外，还发现了溶菌酶家族蛋白（MHN6395638.1）和含氨基葡萄糖苷酶结构域的蛋白（MHN6394094.1），这两种蛋白都属于肽聚糖水解酶家族（11，12）。此外还发现了fabG基因（MHN6393495.1），该基因可作为用于生产聚羟基丁酸的phaB基因发挥作用（13）。支持SP-50a菌株具有抗菌活性及能生产PHB的初步分析结果见图1。

表1

表1 Enterococcus lactis SP-50a的基因组组装及注释统计信息^a

参数	数值
组装统计信息	?
????读段质量中位数	22.5
????读段长度中位数（bp）	2611
????总碱基对数（Mb）	418.96
????总读段数	98,646
????组装后的连续序列数量	2
????N50值（Kb）	7.294
基因组指标
????基因组大小（bp）	2,715,204
????G + C百分比	38
????CDS总数	2,547
????含有蛋白质的CDS数量	2,417
????不含蛋白质的CDS数量	130
????基因总数	2,637
????rRNA基因数量	6（5s）、6（16s）、6（23s）
????tRNA基因数量	68
????Checkm完整性百分比	99.06
????CheckM污染百分比	0.94
????SRA登录号	SRR37701720
????GenBank登录号	JBWDIX000000000.1
????BioProject编号	PRJNA224116
????BioSample编号	SAMN56532058

^a

组装统计信息是用NanoPlot v 1.46.2软件（14）获取的，基因组注释则是通过NCBI原核生物基因组注释流程（PGAP）V. 6.10完成的。

图1

src="/cms/10.1128/mra.00434-26/asset/2576c6cc-c223-4bb5-b142-50415c87531b/assets/images/medium/mra.00434-26.f001.gif" height="312" width="500" data-viewer-src="/cms/10.1128/mra.00434-26/asset/168efa35-cdae-495d-8706-d2444656b355/assets/images/large/mra.00434-26.f001.jpg" loading="lazy" data-target="core-fv-F1" data-index="0" data-open="viewer">

图1 对Enterococcus lactis SP-50a菌株的抗菌活性、肽聚糖水解酶活性以及PHB生产能力进行的初步测试。（A）粗制细菌素提取物对Listeria innocua AST 062的抑制圈；（B）肽聚糖水解酶对Klebsiella pneumoniae ATCC 10031的抑制圈；（C）用苏丹黑染色的Enterococcus lactis SP-50a菌株和E. coli BL 21菌株的菌落；（D）在100倍放大倍数下，用光学显微镜观察经苏丹黑染色的Enterococcus lactis（SP-50a）菌细胞的显微照片（德国韦茨拉尔，莱卡显微镜公司）：绿色箭头指向呈蓝黑色、能积累PHA的菌细胞，黑色箭头指向呈特征性玫瑰色的、不能积累PHA的菌细胞。

致谢

作者声明，本研究及本文的发表得到了资金支持。该项工作由墨西哥国家技术研究院资助（项目代码：14073.22-P和18396.23-P）。I.D.C.F.-B：由CONACYT提供资助（授权号815355）；K.G.á.-V：由CONACYT的博士后奖学金计划资助（编号693618）。