从日本河流水中分离出的四环素抗性细菌——内生变杆菌HR3-A的完整基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequence of a tetracycline-resistant bacterium, Variovorax endophyticus HR3-A, isolated from riverine water in Japan

　　

摘要

本研究测定了存在于日本河流水中的四环素耐药细菌Variovorax endophyticus HR3-A的基因组序列，旨在明确与抗菌耐药性相关的遗传特征。

研究通报

人类在生活、工业和农业活动等过程中向环境中排放的各种污染物对抗生素耐药性的影响，因其潜在的健康风险而受到广泛关注（1，2）。为进一步研究水生抗生素耐药细菌，我们分离并测序了一种新的水生Variovorax菌株HR3-A的基因组。

HR3-A是从2023年6月21日采集的日本茨城县北利根河的水样中获得的（坐标：36°11'29"N 140°31'52"E）（2）。我们使用酚氯仿提取法结合溶菌酶缓冲液，从在30°C下于R2A（富士胶片和光纯药公司，日本）-1.5%琼脂培养基上生长3天的HR3-A细胞菌落中提取基因组DNA（2–4）。利用Native Barcoding Kit（SQK-RBK114.24；牛津纳米孔技术公司，英国）基于HR3-A基因组DNA制备了纳米孔测序文库，并在PromethION平台（R10.4.1，ONT）上进行测序。碱基调用和适配子序列去除工作是通过Porechop v0.2.4结合Dorado v7.3（SUP模型）完成的（5）。随后使用Chopper v0.7.0对长度小于1,000 bp的读取序列进行了清理（6）。最终，从纳米孔文库中获得了46,102条长读取序列（总碱基数为529,843,304；N₅₀值为19,260 bp）。另外，还使用相同的基因组DNA制备了一个150-bp的双端文库，该DNA先通过ME220聚焦超声仪（Covaris，美国）进行片段化，然后使用AMPureXP（贝克曼库尔特，美国）进行纯化和大小筛选，之后再利用MGIEasy PCR-free DNA文库制备试剂盒（MGI Tech，中国）进行测序，测序在DNBSEQ-G400RS平台（MGI Tech）上进行。对于MGI读取的序列，使用Cutadapt v4.9进行了适配子序列去除和读取过滤（参数为“--overlap 10”、“--minimum-length 51”和“--quality-cutoff 20”）。经过过滤后的MGI读取序列被进一步降采样为2,000,000条双端读取序列（总碱基数为598,560,956），以便后续分析。

纳米孔读取序列通过Trycycler v0.5.4（8）进行组装，从而得到环状连续序列，这些序列随后又通过Medaka v2.0.1进行了优化处理。对于MGISEQ短读数据集，则使用了Burrows-Wheeler Aligner v0.7.12（9）和Pilon v1.23（10）进行处理。基因组序列的注释工作是使用DFAST v1.3.9（11）完成的。基因组的完整性则是通过基于NCBI数据库确定的参考物种，在DFAST_QC v1.1.1（13）中使用CheckM v1.2.4来检测的。完整的基因组还通过DFAST_QC中的平均核苷酸一致性分析进行了评估。除特别说明外，所有软件均采用默认参数。

该基因组长度为10,011,889 bp，覆盖度为56.4倍，GC含量为69.0%，最终被组装为两个连续序列。HR3-A的基因组特征详见表1。为确定与其亲缘关系最近的物种，我们使用了Variovorax endophyticus CY25R-8^T菌株的初步基因组序列（NCBI登录号：GCF_025376855.1）（14）计算了全基因组平均核苷酸一致性，结果显示HR3-A基因组与该菌株的序列相似度为96.35%。HR3-A染色体上存在与抗生素耐药性相关的假定基因（如bla基因与氨苄西林耐药性相关，tetA基因与四环素耐药性相关）。我们还发现了编码4型接合菌毛的基因以及可能与细菌与植物间相互作用相关的假定内葡聚糖酶基因。

表1

表1Variovorax endophyticus HR3-A的基因组特征

基因组特征	连续序列1	连续序列2
总长度（bp）	7,570,958	2,440,931
别名	染色体	染色质粒
形态	环状	环状
GC含量（%）	69.1	68.7
CDS数量	6,936	2,182
rRNA数量	6	3
tRNA数量	76	7
tmRNA数量	1	0
完整性（%）	98.77

致谢

感谢西泽昭人博士分享其实验流程。

本研究得到了River Foundation的资助（资助编号：2023-5211-025）。