单细胞多组学技术鉴定ALDH9A1–肉碱信号轴驱动非小细胞肺癌对免疫治疗的耐药性

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Single-cell multiomics identifies an ALDH9A1–carnitine signaling axis driving resistance of NSCLC to immunotherapy

　　

尽管免疫检查点抑制剂（ICIs）已彻底改变了非小细胞肺癌（NSCLCs）的临床管理，但大多数患者最终会出现原发性或获得性耐药，限制了长期治疗获益。本研究通过整合来自NSCLC肿瘤的CODEX、代谢组学、CyTOF、ATAC-seq和单细胞空间转录组学，研究人员发现了ALDH9A1在促进抗PD-1治疗耐药中一个未被认识的作用。在免疫功能健全（而非免疫缺陷）的小鼠模型中，ALDH9A1的缺失显著抑制了肿瘤生长。这种效应伴随着三级淋巴结构成熟的增加以及肿瘤免疫微环境中促肿瘤性MDSCs积累的减少。机制上，ALDH9A1驱动的肉碱（carnitine）产生提升了乙酰辅酶A（acetyl-CoA）水平，重塑了染色质可及性，并激活了肿瘤细胞中的Il1b超级增强子（superenhancers），从而促进了MDSC极化和CD8⁺ T细胞耗竭。在体内，对ALDH9A1进行遗传或药理学抑制，或通过抗体介导的IL-1β中和，可抑制肿瘤进展并恢复对抗PD-1治疗的敏感性。IL-1β进一步激活NF-κB并上调ALDH9A1，形成了一个反馈性的ALDH9A1-IL-1β环路。重要的是，在NSCLC患者中，ALDH9A1/IL-1β轴经常被过度激活，并且与对抗PD-1免疫治疗的不良反应相关。总之，本研究揭示了一个先前未被充分认识的NSCLC特异性免疫调节通路，并将ALDH9A1确定为提高免疫治疗疗效的一个有前景的治疗靶点。

**研究背景与问题**
免疫检查点抑制剂（ICIs）虽然革新了非小细胞肺癌（NSCLC）的临床治疗，但多数患者最终会发展出原发性或获得性耐药，限制了长期疗效。肿瘤免疫微环境（TIME）的重编程被认为是驱动这种耐药性的主要机制。然而，既往研究多依赖简化的二维系统或传统小鼠模型，难以模拟人类NSCLC复杂的结构和细胞互作。单细胞空间转录组学和CODEX（共检测索引）成像等新技术为解析ICIs反应性背后的空间细胞生态系统提供了机会。本研究旨在通过整合多组学策略，鉴定驱动NSCLC免疫治疗耐药的关键决定因素。该论文发表在《Proceedings of the National Academy of Sciences》。

**主要技术方法**
研究人员应用了整合多组学策略，包括：单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析24例NSCLC患者肿瘤样本（来自瑞金医院）；CODEX成像技术（使用35种抗体）对20例显微切割的NSCLC标本进行空间蛋白质组学分析；CyTOF（飞行时间质谱流式细胞术）进行免疫细胞图谱分析；ATAC-seq（转座酶可及性染色质测序）和H3K27ac ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序）进行表观遗传学分析；以及小鼠模型（包括KP基因工程小鼠模型和LLC1同系移植模型）进行体内功能验证。

**研究结果**
**1. 单细胞空间转录组学和脂质组学分析鉴定ALDH9A1为与NSCLC抗PD-1抗体耐药相关的候选基因**
通过对24例NSCLC患者的肿瘤进行scRNA-seq，研究人员发现，与应答者肿瘤相比，非应答者肿瘤中CD8⁺ T细胞浸润减少，而PMN-MDSCs（多形核髓系来源的抑制细胞）富集。差异表达分析显示，ALDH9A1是非应答者肿瘤中上调最显著的代谢基因之一。脂质组学分析证实非应答者肿瘤中肉碱相关代谢物积累增加。

**2. CODEX分析进一步验证了高ALDH9A1蛋白水平与临床患者NSCLC免疫逃逸之间的空间关系**
CODEX成像分析表明，ALDH9A1高表达肿瘤中CD8⁺ T细胞浸润减少，而MDSC细胞富集增加。量化分析证实，ALDH9A1蛋白强度与肿瘤中心CD8⁺ T细胞邻域评分呈负相关，与MDSC邻域评分呈正相关，且与三级淋巴结构（TLS）成熟度负相关。

**3. Aldh9a1基因缺失显著限制免疫健全小鼠的肺癌进展并促进三级淋巴结构成熟**
在KP小鼠模型中，诱导性敲除Aldh9a1显著减小了肿瘤负荷并延长了小鼠生存期。在LLC1同系移植模型中，敲低Aldh9a1在免疫健全小鼠中抑制了肿瘤生长，但在裸鼠中无效，表明ALDH9A1通过重塑TIME发挥作用。转录组分析显示，Aldh9a1敲除肿瘤中趋化因子产生和炎症反应通路上调，TLS成熟度增加，CD4⁺和CD8⁺ T细胞密度升高。

**4. CyTOF和拟时序轨迹分析揭示ALDH9A1驱动小鼠肺癌微环境中的免疫抑制性MDSC极化和CD8⁺ T细胞耗竭**
CyTOF分析显示，Aldh9a1^-/-小鼠肿瘤中M-MDSCs和PMN-MDSCs减少，而抗癌T淋巴细胞富集增加。拟时序分析揭示了MDSCs的分化轨迹。CellChat分析表明，MDSCs主要通过CD80-CTLA4和NECTIN2-TIGIT等共抑制信号与CD8⁺ T细胞通讯，并存在IL-1β信号互作。

**5. ALDH9A1抑制剂逆转MDSC驱动的CD8⁺ T细胞耗竭并提升肺癌免疫治疗效果**
ALDH9A1抑制剂DEAB（二乙氨基苯甲醛）显著抑制了LLC1肿瘤生长，增加了CD69⁺CD44⁺CD8⁺ T细胞数量，并提高了抗肿瘤基因表达。DEAB的抗肿瘤作用依赖于CD8⁺ T细胞。DEAB与抗PD-1抗体联合治疗显示出更强的抗肿瘤效果。在OVA⁺过继性T细胞转移模型中也观察到类似增效作用。纳米颗粒介导的siRNA沉默ALDH9A1也重现了DEAB的表型。

**6. 空间蛋白质组学映射揭示DEAB诱导的NSCLC TIME重塑**
CODEX空间蛋白质组学分析显示，DEAB处理减少了肿瘤上皮区域，扩大了免疫富集区域，并降低了CD8⁺ T细胞的PD-1表达。精细聚类分析表明，DEAB处理将CD8⁺ T细胞从耗竭状态（Tex）转变为记忆和效应状态，伴随GZMB、IFNG和CD44上调及PD-1、TOX下调。

**7. ALDH9A1增强的IL-1β信号驱动肺癌中的TIME重编程**
体外实验表明，ALDH9A1通过IL-1β-IL-1R1轴促进MDSC趋化和抑制功能。在Aldh9a1转基因小鼠模型中，抗IL-1β抗体可逆转肿瘤生长加速、MDSC富集和CD8⁺ T细胞减少。临床数据分析显示，ALDH9A1与IL-1β表达正相关，且与髓系免疫抑制微环境相关。

**8. ALDH9A1诱导的顺式调控重塑染色质可及性并激活NSCLC中的Il1b超级增强子**
ATAC-seq和H3K27ac ChIP-seq分析表明，ALDH9A1缺失导致Il1b基因座的染色质可及性降低，特别是其超级增强子区域的H3K27ac信号减弱。进一步分析显示，ALDH9A1驱动的肉碱代谢通过增加乙酰辅酶A（acetyl-CoA）通量来支持组蛋白乙酰化，从而重塑Il1b超级增强子区域的染色质可及性。

**9. IL-1β或PD-1抑制剂激活RelA与Aldh9a1启动子的结合，形成NSCLC细胞中的正反馈ALDH9A1/IL-1β环路**
研究发现，IL-1β和抗PD-1抗体均可通过激活NF-κB/RelA转录因子来上调ALDH9A1表达。ChIP实验证实RelA直接结合ALDH9A1启动子上的一个关键位点，从而形成了一个ALDH9A1-IL-1β的正反馈环路。

**讨论与结论**
本研究鉴定了一个ALDH9A1–肉碱–Il1b轴作为NSCLC免疫逃逸的关键调控通路。ALDH9A1表达的肿瘤细胞通过增加IL-1β产生，招募并极化MDSC，导致CD8⁺ T细胞耗竭和免疫治疗耐药。IL-1β反过来又通过NF-κB进一步诱导ALDH9A1，形成维持免疫抑制的恶性循环。通过遗传学敲除、药理学抑制或阻断IL-1β信号来破坏这个环路，可减少MDSC积累、减轻CD8⁺ T细胞耗竭、增强TLS成熟，并延长生存期。多组学分析将代谢重编程与炎症细胞因子调控联系起来，揭示了异常肉碱代谢在免疫抑制中的核心作用。这些发现提名ALDH9A1为有前景的治疗靶点，并为开发针对免疫治疗耐药性NSCLC的ALDH9A1导向干预策略提供了理论依据。