综述：结直肠癌中的昼夜节律-微生物组-免疫轴：时空免疫抑制的机制与时间治疗前景

《Frontiers in Immunology》：The circadian-microbiome-immune axis in colorectal cancer: mechanisms of spatiotemporal immunosuppression and chronotherapeutic horizons

　　

结直肠癌（CRC）仍然是一个主要的全球肿瘤学挑战，很大程度上是因为大多数微卫星稳定（MSS）肿瘤对免疫检查点阻断（ICB）表现出内在耐药性。新兴证据表明，肠道微生物组和宿主昼夜节律共同调节黏膜稳态；然而，它们的动态整合——在此定义为昼夜节律-微生物组-免疫轴——在CRC中仍未被完全理解。在这篇综述中，研究人员综合了关于该轴的临床前发现和有限的可用临床证据。使用遗传和生活方式相关昼夜节律破坏模型进行的实验研究表明，时钟功能障碍可能损害肠道黏膜屏障并改变微生物组成，包括有益菌群如乳杆菌属（Lactobacillus）的减少。这些变化与代谢重塑相关，包括增加牛磺胆酸（TCA），在细胞和动物模型中已被证明可激活RasGRF1/MAPK/ERK通路。临床前证据进一步表明，肠道时钟破坏可能与Wnt信号和趋化因子网络（包括CXCL5和IL-17）相互作用，从而促进表达PD-L1的髓系来源抑制细胞（MDSCs）的节律性募集。在此基础上，研究人员提出时间免疫抑制盾（TIS）作为一个假设生成的概念框架，将上皮屏障功能障碍、微生物代谢重塑和暂时性髓系介导的细胞毒性CD8⁺ T细胞抑制联系起来。由于这一整合模型尚未在人类MSS CRC中直接验证，因此不应被视为已建立的生物学机制。研究人员还讨论了生物相位对齐的ICB和化疗的潜力，概念上称为时间免疫治疗（chronoimmunotherapy），同时强调了目前昼夜节律生物标志物开发、个体间差异以及从小鼠到人类转化方面的挑战。总体而言，这篇综述概述了一个可测试的时空框架，并确定了评估其与CRC治疗耐药相关性的必要实验和临床研究。

1 Introduction: the spatiotemporal nexus of time, microbes, and colorectal cancer
结直肠癌（CRC）是全球最常见和致命的恶性肿瘤之一，对公共健康构成沉重负担。尽管靶向PD-1/PD-L1通路的免疫检查点阻断（ICB）已改变转移性MSI-H/dMMR CRC的治疗，但在更广泛的CRC人群中获益有限，尤其是pMMR/MSS CRC对PD-1单药治疗几乎无反应。pMMR/MSS CRC常表现为非炎症性肿瘤微环境，细胞毒性T细胞浸润有限，这成为ICB反应的潜在障碍。近年来，黏膜稳态被认识到是由肠道微生物组与宿主昼夜节律之间相互作用塑造的动态过程。在细胞水平，生物钟是由转录-翻译反馈环驱动的进化保守计时系统，主要由转录因子CLOCK和BMAL1调控。在胃肠道中，昼夜节律调节上皮、干细胞和免疫细胞程序。同时，肠道微生物组与肠黏膜和免疫系统相互作用以维持稳态。实验模型中记录了微生物组成和代谢产物的日间振荡，但其对人类肠道屏障功能的贡献尚不完全明确。现有证据表明宿主昼夜节律与肠道微生物组之间存在双向稳态关系，即昼夜节律-微生物组-免疫轴。实验研究显示宿主昼夜节律、微生物组成和宿主代谢转录程序之间存在相互关联。遗传性上皮时钟破坏和睡眠剥夺均与实验模型中肠道稳态受损和CRC相关表型相关。独立研究表明髓系及其他免疫细胞具有细胞内在的昼夜节律程序，调节炎症反应，而肠道黏液屏障对维持宿主-微生物区室化至关重要。临床前CRC研究将上皮时钟破坏与屏障功能障碍和微生物失调联系起来。在小鼠CRC模型中，表达PD-L1的MDSCs表现出节律性积累并抑制CD8⁺ T细胞活性，提示其可能对ICB耐药有贡献，但该机制尚未在人类MSS CRC中直接验证。本综述通过提出的时间免疫抑制盾（TIS）框架综合这些新兴观察。TIS不同于现有宿主时钟-微生物组模型，聚焦于CRC特异性的空间组织假说，即上皮屏障损伤、微生物相关代谢重塑和暂时性髓系介导的免疫排斥可能汇聚于pMMR/MSS肿瘤。该框架补充而非替代更广泛的基于细菌的治疗概念和微生物组-免疫框架。TIS将三个相互依赖的层面联系起来：上皮屏障功能障碍作为潜在空间入口点，微生物相关代谢重塑作为生化中继，以及暂时性髓系积累和CD8⁺ T细胞抑制作为候选效应层。TIS不应被解释为独立验证的生物学实体或现有昼夜节律-微生物组模型的替代品，而是将临床前研究和有限临床关联组织成一系列可测试的预测。后续章节将检查昼夜节律破坏可能损害上皮屏障完整性并重塑微生物组成的证据，讨论候选代谢通路包括TCA和RASGRF1/MAPK/ERK信号，评估将上皮时钟破坏与节律性髓系积累和CD8⁺ T细胞活性改变联系起来的临床前数据，并考虑相位对齐疗法的研究潜力，同时强调当前缺乏验证的人类生物标志物、前瞻性CRC特异性试验以及TIS完整序列在患者中运行的直接证据。

2 Intestinal clock disruption and gut dysbiosis in CRC: evidence from mucosal barrier models
2.1 Intestinal epithelial Bmal1 ablation and mucosal barrier dysfunction
BMAL1（脑和肌肉ARNT样蛋白1，由ARNTL编码）是分子昼夜节律的核心转录调控因子，与CLOCK一起驱动节律性转录程序，支持细胞自主计时。这里“上皮时钟”指肠上皮细胞内运行的细胞自主分子昼夜节律计时系统，而非中央昼夜节律起搏器或整体睡眠-觉醒节律。该局部计时系统参与调控黏蛋白相关和紧密连接相关基因，从而帮助维持上皮屏障稳态。实验中使用Villin-Cre系统进行上皮特异性Bmal1缺失，以破坏局部肠道上皮时钟，并检查上皮昼夜节律组织丧失如何影响黏液产生、连接完整性和旁细胞通透性。在引用的Apc驱动CRC模型中，Apc和Bmal1选择性缺失于肠上皮细胞，而外周时钟保持完整，因此该设计检测局部上皮时钟贡献而非全身性昼夜节律破坏。肠道黏液层形成主要生物物理屏障，限制管腔微生物与下层上皮的直接接触。在健康肠黏膜中，凝胶形成黏蛋白2（由Muc2编码）和跨膜黏蛋白如黏蛋白3（由Muc3编码）参与黏液产生和屏障维护。在Villin-Cre介导的肠道上皮Bmal1缺失的Apc^+/-小鼠模型中，报道了多种黏蛋白相关基因（包括Muc2、Muc3、Muc3a和Muc13）表达降低。高碘酸-希夫染色显示这些模型中晚期肿瘤区域杯状细胞减少和黏液厚度降低。这些发现支持上皮时钟丧失与黏液屏障完整性受损之间的临床前关联，但尚不确定这些改变是否直接启动结直肠肿瘤发生或与人类CRC程度相同。上皮紧密连接复合物参与调节旁细胞通透性并限制管腔抗原易位。连接相关蛋白包括occludin（由Ocln编码）和闭锁小带蛋白1（ZO-1，由Tjp1编码）。在肠道上皮Bmal1缺失的Apc缺失小鼠模型中，转录组分析识别出多种连接相关基因（包括Ocln、Cldn7、Cldn15和Tjp1）表达降低，同时观察到Cldn8表达升高，可能反映代偿反应而非整体屏障功能保留。在其他上皮组织中已报道紧密连接组分的昼夜节律变化，但这些观察对人类CRC的相关性仍不确定。总体而言，现有证据支持上皮时钟破坏与临床前模型中紧密连接调控改变之间的关联，但未在患者中建立等效机制。来自同步化人类Caco-2单层的补充证据表明屏障相关基因受细胞自主昼夜节律调控，但该体外系统不应视为临床验证。在同步化培养中，核心时钟基因（包括BMAL1和NR1D1）和连接相关基因（包括OCLN和CLDN8）表现出节律性表达。在Apc驱动小鼠模型中，单层实验性时钟破坏以及上皮Bmal1丧失与4-kDa荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖的旁细胞通透性增加相关。啮齿动物环境昼夜节律破坏研究还报道了肠道生理和微生物组成改变。这些发现支持昼夜节律调控在上皮屏障完整性中的临床前作用，但缺乏人类CRC组织和前瞻性患者队列的直接验证。

2.2 Barrier dysfunction and clock-associated microbial dysbiosis in CRC
屏障破坏可能创造有利于微生物群落结构改变的条件，但该关系的方向性尚未完全解决。在荷瘤时钟缺陷的Apc^+/-；Bmal1^-/-小鼠中，宏基因组分析发现与对照组相比，厚壁菌门相对丰度降低，拟杆菌门相应扩张。这些发现表明上皮时钟丧失在该临床前背景下与门水平失调相关。然而，门水平变化在分类学上较宽泛，可能因饮食、饲养条件、测序方法和基线微生物组成而异，不应解释为人类CRC的通用微生物特征。这些组成变化是否因果性地导致屏障功能障碍、炎症或肿瘤进展需要菌株水平和功能验证。在物种水平，时钟缺陷CRC小鼠模型的多变量分析识别出多个分类群相对丰度增加，包括Bacteroides acidifaciens、Bacteroides caecimuri、Bacteroides thetaiotaomicron和Helicobacter apodemus。这些观察表明上皮时钟破坏与临床前背景下选定微生物物种富集相关，但未确定这些分类群具有致病性或因果参与CRC进展。Bacteroides thetaiotaomicron在膳食多糖有限时具有利用宿主来源黏蛋白聚糖的能力。在预先存在屏障损伤的条件下，这种黏蛋白觅食活动可能进一步导致黏液层变薄，但该过程是否在时钟破坏CRC模型中实质性增加肠道通透性或微生物易位尚未直接证明。因此，屏障功能障碍与黏蛋白利用细菌之间的前馈相互作用应视为生物学上合理但未完全验证的机制。在同一临床前研究中，时钟破坏还与多种其他分类群相对丰度增加相关，包括Fusobacterium mortiferum、Parasutterella excrementihominis和Paramuribaculum intestinale。在引用的研究中，Apc^Min/+小鼠的睡眠剥夺通过改良多平台范式诱导，包括24小时剥夺后48小时恢复，重复12周。因此，动物在每个72小时周期中三分之一时间内暴露于剥夺条件，但实际睡眠持续时间未客观记录，相对于正常睡眠时间的百分比减少未报告。该33.3%的值描述实验暴露方案而非直接测量的睡眠损失百分比。在引用的研究中，乳杆菌属被鉴定为睡眠剥夺小鼠中相对丰度降低最显著的属，但发表的16S rRNA分析未解析或报告特定乳杆菌物种或菌株。这些观察表明微生物群落结构和功能发生变化，但单个分类群的生物学意义仍不确定。乳杆菌的效应可能依赖于菌株和背景，现有证据未确定其耗竭直接损害人类CD8⁺ T细胞活性或促进CRC进展。因此，这些分类学变化应解释为模型依赖的关联，需通过菌株分辨测序、代谢物分析和功能干预研究进行验证。除上述分类群外，CRC免疫治疗研究报道了ICB反应与几种共生群（包括Akkermansia、Bifidobacterium和Faecalibacterium）之间的关联，但现有CRC证据数量有限，治疗方案、队列组成和测序策略异质，无法确定任何单一分类群为反应的因果决定因素。这些生物应视为候选微生物相关因素而非通用生物标志物。在功能水平，短链脂肪酸（SCFAs）、吲哚衍生物和胆汁酸提供了微生物生态学影响上皮和免疫状态的合理途径，但其昼夜节律动态、组织暴露和在pMMR/MSS CRC中的疾病特异性仍不明确。

3 Preclinical evidence for circadian disruption-associated metabolic remodeling: a candidate TCA–RASGRF1–MAPK/ERK pathway
睡眠剥夺的Apc^Min/+小鼠的代谢组学分析识别出粪便代谢物谱变化，包括牛磺酸和亚牛磺酸代谢相关通路富集。牛磺胆酸（TCA）是粪便样本中增加的代谢物之一，并通过酶联免疫吸附试验进一步评估。在该小鼠模型中，粪便TCA水平与乳杆菌属相对丰度呈负相关。由于某些乳杆菌菌株具有胆汁盐水解酶活性，这些细菌丰度降低可能合理导致结合胆汁酸代谢改变，但微生物胆汁盐水解酶活性、宿主胆汁酸合成、肠道转运及其他微生物功能的相对贡献尚未解决。这些发现支持睡眠剥夺、微生物组改变和粪便TCA增加之间的临床前关联，但未确定该通路在人类CRC中一致发生或TCA是昼夜节律破坏相关肿瘤进展的主要介质。实验研究检查了临床前CRC模型中升高的TCA的潜在促肿瘤效应。在人类CRC细胞系（包括HCT116和SW480）中，外源性TCA处理与细胞活力、克隆形成生长、迁移和侵袭能力增加相关。TCA暴露还降低了这些实验系统中连接相关蛋白ZO-1和E-钙黏蛋白的表达，提示可能促进上皮屏障功能障碍。在携带HCT116异种移植的裸鼠中，全身性TCA给药与肿瘤体积和肿瘤重量增加相关。相关体内证据进一步表明胆汁酸暴露改变可能影响CRC进展。这些发现支持TCA在临床前模型中的促肿瘤作用，但人类CRC中TCA的生理相关浓度、药代动力学和组织暴露仍不明确。除TCA外，微生物代谢物包括短链脂肪酸（SCFAs）在实验模型中表现出日间变化。饮食和微生物扰动可能改变这些节律，但其与CRC的相关性仍不确定。SCFAs可通过组蛋白去乙酰化酶抑制和G蛋白偶联受体信号影响上皮和免疫细胞功能，但直接连接昼夜节律破坏、SCFA可用性改变和人类CRC进展的证据有限。因此，SCFA相关免疫重塑应视为昼夜节律-微生物组-免疫轴的生物学合理组分而非人类CRC中的既定机制。微生物相关色氨酸代谢代表昼夜节律破坏与黏膜免疫之间的另一个潜在联系。膳食色氨酸可用性和微生物群落组成可影响微生物色氨酸代谢和吲哚衍生物（包括吲哚-3-丙酸和吲哚-3-乳酸）的产生，但负责通路是物种和菌株依赖的。这些代谢物可激活上皮和免疫细胞中的芳烃受体（AhR），从而影响实验系统中屏障相关转录和IL-22相关黏膜反应。某些乳杆菌菌株可贡献吲哚代谢，但乳杆菌丰度降低不应假定为跨宿主产生一致的AhR信号丧失。此外，直接证明昼夜节律破坏改变CRC中这些代谢物的时间产生或此类改变驱动人类髓系募集和免疫治疗耐药性的证据仍然缺乏。色氨酸-AhR-IL-22通路应视为生物学合理但未完全验证的昼夜节律-微生物组-免疫轴组分。TCA处理的CRC细胞中的机制研究将MAPK信号作为候选下游通路。转录组分析和基因集富集分析（GSEA）将Ras蛋白特异性鸟嘌呤核苷酸释放因子1（RASGRF1）识别为Ras-RAF-MEK-ERK级联的潜在上游调控因子。来自其他肿瘤背景的支持证据表明RASGRF1可调节Ras/MAPK活性，而MAPK信号是CRC进展的公认贡献者。在这些实验系统中，TCA暴露伴随RASGRF1表达增加和ERK磷酸化。使用SCH772984的药理学ERK抑制或使用小发夹RNA的RASGRF1遗传沉默减弱了TCA相关的细胞增殖、迁移和侵袭。这些发现支持临床前TCA-RASGRF1-MAPK/ERK信号轴，但其浓度依赖性、肿瘤背景特异性和在人类CRC标本中的有效性仍有待建立。总体而言，本节总结的研究未确定昼夜节律破坏通过TCA、SCFAs或色氨酸衍生代谢物在人类中引起CRC发展。大多数机制证据来自CRC细胞系、小鼠模型或其他实验系统，缺乏CRC患者的直接验证。引用的研究未提供整合的时间分辨的循环、粪便和肿瘤内代谢物浓度、药代动力学或组织暴露测量。此外，可用的人类观察未展示从昼夜节律破坏到代谢物重塑、髓系细胞募集和免疫治疗耐药性的完整因果序列。因此，TCA-RASGRF1-MAPK/ERK轴及其他讨论的代谢物通路应解释为候选临床前机制和未来验证的优先事项，而非CRC启动、进展或治疗反应的既定决定因素。

4 Preclinical evidence for rhythmic myeloid-mediated immunosuppression in CRC
临床前证据表明，昼夜节律破坏相关的代谢重塑可能与局部免疫信号变化同时发生。在Apc驱动小鼠模型和肠上皮系统中，上皮时钟破坏与Wnt/β-catenin信号改变及选定趋化因子和细胞因子表达增加相关。多重细胞因子分析识别出CXCL5、IL-5、CCL5和IL-17为上皮Bmal1缺失后改变的因素。在这些介质中，CXCL5被提议为候选时钟敏感趋化吸引剂。这些发现支持上皮时钟丧失和Wnt失调合作产生有利于中性粒细胞和单核细胞髓系细胞募集到结直肠肿瘤微环境的趋化环境的可能性，但每种趋化因子的相对贡献及该通路在人类MSS CRC中运行的程度仍不确定。在时钟破坏的Apc驱动小鼠模型中，募集的髓系细胞获得与免疫抑制MDSC表型一致的转录和功能特征。CD45⁺肿瘤浸润免疫细胞的单细胞RNA测序识别出一个富含抑制相关基因（包括S100a8、S100a9、Wfdc17和Arg2）的髓系簇。这些标志物与未成熟髓系状态和免疫抑制活性相关：S100A8和S100A9可能支持MDSC样群体的积累和维持，而精氨酸酶活性、活性氧和PD-L1表达代表髓系细胞损害T细胞反应的既定机制。在共培养实验中，从这些小鼠模型分离的Gr-1⁺髓系细胞以剂量依赖方式抑制CD8⁺ T细胞增殖和颗粒酶产生。这些发现支持临床前CRC模型中存在功能性抑制髓系群体，但未确定相同细胞亚群或抑制机制在人类MSS CRC中运行。临床前证据进一步表明，肿瘤相关髓系细胞的丰度和抑制活性可能随昼夜节律相位变化。在小鼠肠道肿瘤模型中，Gr-1⁺ PD-L1⁺髓系细胞表现出节律性积累，在早期活动期（Zeitgeber Time 16，ZT16）报道丰度较高。相比之下，Apc^+/-；Bmal1^-/-小鼠的上皮时钟破坏与该节律模式丧失和髓系细胞积累持续升高相关。这些观察支持临床前CRC模型中存在潜在的时间门控免疫抑制窗口。在表达PD-L1的髓系细胞积累增加的阶段，CD8⁺ T细胞活性降低可能促进肿瘤免疫逃逸，但该现象的时间谱、细胞组成和临床相关性尚未在人类MSS CRC中建立。MDSCs仅是CRC免疫抑制微环境的一个组分。调节性T细胞、肿瘤相关巨噬细胞、耐受性树突状细胞和自然杀伤（NK）细胞也可塑造CRC中效应细胞募集或活性，但其直接整合到昼夜节律-微生物组轴中尚未建立。在实验系统中已描述巨噬细胞和树突状细胞的昼夜节律程序，但共同测量时钟状态、微生物特征和这些免疫群体的CRC特异性研究仍然稀缺。因此，本综述将MDSCs视为当前证据基础中发展最好的例子，而非唯一的免疫抑制效应群体。

5 Translational horizons: shaping the chronoimmunotherapy of colorectal cancer
临床前研究表明，当肿瘤相关髓系群体在昼夜节律周期中变化时，抗PD-L1给药的时机可能影响治疗反应。在Apc^+/-；Bmal1^-/-小鼠模型中，抗PD-L1每周两次在ZT4或ZT16给药以评估该相位依赖假说。ZT16治疗与肿瘤浸润Gr-1⁺ MDSCs积累较低和CD8⁺ T细胞浸润较高相关，优于ZT4治疗。在为期三周的治疗期内，两种方案均未显著改变总息肉数量，而在ZT16治疗组观察到息肉大小减小。这些发现提供治疗时机可能改变抗PD-L1活性的临床前证据，但未确定CRC患者的最佳给药方案。免疫检查点抑制剂输注时机与临床结局之间的观察性关联已在其他癌症（包括黑色素瘤）中报道，但缺乏前瞻性CRC特异性验证。使用同基因皮下MC38肿瘤模型的额外临床前证据表明，在ZT16给药抗PD-L1与14个肿瘤中4个完全缓解（29%）相关，而ZT4治疗组为12个肿瘤中1个（8%）。ZT16组14个肿瘤中4个（29%）出现疾病进展，ZT4组12个肿瘤中6个（50%）。尽管这些数值差异与治疗反应的潜在时间效应一致，但适中的样本量和鼠皮下肿瘤模型的使用限制了直接临床解释。这些发现应视为支持假说的临床前证据，而非证明CRC患者中存在相应最佳治疗窗口。将这些发现转化到患者需要个体化昼夜节律相位评估，而非将鼠ZT16直接转换为人类固定时钟时间。未来研究的候选相位标志物包括暗光褪黑素起始（DLMO）、睡眠-觉醒时间和外周血中时钟基因转录物（如PER2和BMAL1）的系列测量，但其可重复性和对CRC治疗安排的预测价值仍不确定。黑色素瘤观察性研究报道了免疫检查点抑制剂输注时机与临床结局之间的关联，而时间调制化疗已在CRC患者中评估。这些发现未确定CRC中ICB的具体早晨或下午窗口。因此，在推荐个体化时间免疫治疗方案之前，前瞻性研究应比较生物标志物定义的昼夜节律相位和预设给药窗口。临床前证据表明昼夜节律破坏可能通过上述微生物组相关代谢变化影响化疗敏感性。在睡眠剥夺CRC小鼠模型中，粪便微生物移植或乳杆菌补充部分恢复5-FU敏感性，但负责的微生物功能和TCA相关信号的贡献尚未解决。相关研究表明饮食和喂养模式可重塑肠道微生物组的昼夜节律动态，支持微生物组基础昼夜节律调控的更广泛合理性。然而，负责的微生物功能、治疗效果的持久性、微生物组干预的安全性和对人类CRC的相关性尚未建立。因此，将微生物组调理解与时间疗法结合目前应视为实验性策略，需要机制验证和前瞻性临床评估。

5.1 Translational blueprint for future clinical studies
为评估昼夜节律相位是否影响pMMR/MSS转移性CRC患者的治疗反应，一项前瞻性生物标志物告知的试验可比较预设给药窗口，而不假设特定人类时钟时间为最佳。基线评估可包括暗光褪黑素起始（DLMO）、睡眠-觉醒时间和外周血中时钟基因转录物（如PER2和BMAL1）的系列测量，但检测可行性、可重复性和患者负担需要初步验证。参与者可随后随机分配到标准方案或由个体化昼夜节律标志物定义而非直接翻译鼠Zeitgeber Time值的相位对齐方案。抗PD-L1和氟嘧啶基础治疗应单独评估或在精心设计的联合队列中评估，因为现有证据未确定免疫治疗和化疗的最佳昼夜节律相位相同。潜在临床终点可包括安全性、治疗依从性、客观缓解率和无进展生存期，以及CD8⁺ T细胞浸润、循环髓系群体和微生物组相关代谢谱的探索性分析。该设计应视为假设生成框架而非即用临床方案，在正式II期评估前需要先导可行性测试。

6 Critical knowledge gaps and future directions: bridging the chrono-microbiome divide
6.1 Genetic clock ablation versus environmental sleep disruption: mechanistic divergence
澄清遗传时钟消融与环境昼夜节律破坏之间的区别对解释昼夜节律-微生物组-免疫轴的临床前证据很重要。使用Villin-Cre在Apc驱动小鼠模型中肠上皮特异性Bmal1缺失提供了一个可操作的途径来检查上皮时钟的局部功能。在这些实验系统中，上皮时钟丧失与Wnt信号改变、黏蛋白耗竭、屏障功能障碍和趋化因子表达相关。然而，这些模型不排除全身生理、发育补偿或与其他外周时钟相互作用的潜在贡献。相比之下，慢性睡眠剥夺和