融合赖氨酸芽孢杆菌（*Lysinibacillus fusiformis*）作为生物防治剂对大豆立枯丝核菌（*Rhizoctonia solani*）抗真菌活性的评价

《Frontiers in Plant Science》：Evaluation of antifungal activity of Lysinibacillus fusiformis as a biocontrol agent against Rhizoctonia solani in soybean

　　

摘要
引言：立枯丝核菌根腐病寄主范围广，且目前尚无抗性大豆品种，因此该病害是一个严重问题。方法：研究人员评估了65株根际细菌对立枯丝核菌（*R. solani*）的抗真菌活性。结果与讨论：体外实验中，9株根际内生细菌对病原菌具有抑制作用。通过16S rDNA部分序列分析，对最有效的根际细菌分离株进行了属级验证。研究人员在温室和田间条件下研究了该生物防治分离株对立枯丝核菌侵染的影响。与未处理对照相比，该根际细菌分离株显著降低了出苗前和出苗后立枯病的发生率，并提高了植株存活率。融合赖氨酸芽孢杆菌（*L. fusiformis*）处理显著激发了抗氧化酶活性和总酚含量。定量RT-PCR数据显示，经融合赖氨酸芽孢杆菌处理后，所研究的防御相关基因的转录水平显著升高。在受挑战植株中，融合赖氨酸芽孢杆菌处理使PR-1、PR-2、PR-10和PR-12的表达水平达到最高。田间试验表明，该生物防治处理方法显著降低了立枯丝核菌根腐病的发病率，促进了植株生长并提高了产量。本研究揭示了一种有前景的生物防治细菌分离株，可作为控制立枯丝核菌的新型生物制剂。经过进一步的毒理学和生态毒理学评价、制剂开发以及多位点田间试验后，融合赖氨酸芽孢杆菌可能成为开发生物防治剂的有前景的候选菌株。

论文解读：融合赖氨酸芽孢杆菌作为大豆立枯丝核菌生物防治剂的抗真菌活性研究

**研究背景与目的**

大豆是全球最重要的油料和蛋白质作物之一，近年来在全球蛋白质市场中占据重要地位。然而，真菌性病害是导致大豆产量损失的主要生物胁迫因素之一，其中由立枯丝核菌（*Rhizoctonia solani*）引起的根腐病是严重影响大豆产量的病害。该病原菌寄主范围广泛，且目前尚无抗性大豆品种，这使得该病害的防治尤为困难。传统的防治方法主要依赖化学杀菌剂，但长期使用化学农药会导致环境污染和病原菌抗药性增强，同时在有机农业实践中化学农药的使用受到严格限制。因此，开发环境友好、可持续的生物防治策略成为研究热点。利用有益微生物进行生物防治，通过诱导植物系统抗性（ISR）、竞争营养或产生抗真菌物质等机制抑制病原菌，被认为是传统化学防治的有效替代方案。植物根际促生菌（PGPR）已被证明能够通过调节茉莉酸（JA）和乙烯（ET）信号通路激活植物系统性免疫，并增强防御相关酶活性和病程相关（PR）基因表达。近年来，融合赖氨酸芽孢杆菌（*Lysinibacillus fusiformis*）因其在实验室条件下对多种植物病原真菌表现出潜在抗真菌活性而受到关注，但其在大豆立枯丝核菌防治中的实际应用效果及其分子机制尚不明确。本研究旨在筛选高效的根际细菌分离株，评估其对大豆立枯丝核菌的生防潜力，并探讨其诱导大豆系统抗性的生理和分子机制，为开发新型生物防治制剂提供理论依据。

**主要技术方法**

研究人员从埃及Kafr Elsheikh地区受立枯丝核菌侵染的大豆根际土壤中分离得到65株根际细菌，通过体外双重培养法筛选出9株具有抗真菌活性的内生菌株，其中效果最佳的菌株经16S rDNA部分序列分析鉴定为融合赖氨酸芽孢杆菌（*L. fusiformis*），其序列已提交至NCBI GenBank（登录号OP862866）。采用扫描电子显微镜（SEM）观察该菌株对立枯丝核菌菌丝形态的影响。在温室条件下，对大豆种子进行菌悬液浸种处理（浓度10⁸ CFU ml^-1），设置4个处理组（病原菌挑战组、生防菌+病原菌组、生防菌单独处理组和健康对照组），评估立枯病发病率、植株存活率、生长参数（株高、干重）和叶绿素含量。通过分光光度法测定防御酶活性，包括过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和脂氧合酶（LOX），并测定总酚含量。利用定量实时PCR（qRT-PCR）分析4个防御相关基因（PR-1、PR-2、PR-10、PR-12）的相对表达水平，以EF1-α作为内参基因，采用2^?ΔΔCt法计算相对表达量。田间试验在2024和2025两个生长季进行，采用随机区组设计，以噻菌灵（Thiophanate-Methyl）作为阳性对照，评估生防菌处理对病害控制、植株生长和产量指标的影响。

**研究结果**

**3.1 根际细菌鉴定**

通过16S rDNA序列分析，筛选出的最有效分离株与融合赖氨酸芽孢杆菌DSM 2898菌株的同源性达98.58%，系统发育树显示该菌株（命名为Elsharkawy菌株，登录号OP862866）与其它融合赖氨酸芽孢杆菌菌株亲缘关系密切。

**3.2 根际细菌分离株的体外抗真菌活性**

双培养实验表明，融合赖氨酸芽孢杆菌显著抑制立枯丝核菌的生长。扫描电镜观察显示，对照处理中立枯丝核菌菌丝生长正常，形态完整；而与生防菌共培养后，病原菌菌丝出现明显形态异常，包括菌丝溶解等现象。

**3.3 温室条件下融合赖氨酸芽孢杆菌对立枯丝核菌发病率的影响**

融合赖氨酸芽孢杆菌种子处理显著降低了出苗前和出苗后立枯病发生率，植株存活率提高至86%，与未处理对照相比差异显著。该处理有效减轻了立枯丝核菌对大豆种子萌发和幼苗生长的抑制作用。

**3.4 生长促进效果评估**

植物生长参数测定显示，融合赖氨酸芽孢杆菌处理组（无论是单独处理还是与病原菌挑战组合）其株高、根系和地上部干重均显著高于病原菌对照组和健康对照组。其中，融合赖氨酸芽孢杆菌单独处理组株高达到59.8 cm，地上部干重4.2 g，根干重1.3 g，总叶绿素含量4.6 mg/g鲜重，均为各处理组中最高。病原菌挑战导致叶绿素含量显著下降，而生防菌处理有效缓解了这一下降。

**3.5 防御酶活性评估**

在10日龄幼苗中，融合赖氨酸芽孢杆菌处理显著提高了大豆叶片和根系中POD、PPO、PAL和LOX的酶活性。其中，融合赖氨酸芽孢杆菌处理并受病原菌挑战的植株（T2处理）酶活性最高，其次为生防菌单独处理组（T3），病原菌对照组（T1）和健康对照（T4）酶活性较低。根系中的酶活性普遍高于叶片。所有防御酶中，POD活性最高，其次为PPO，PAL活性最低。总酚含量也呈现相似趋势，T2处理组叶片和根系总酚含量分别达6.9和8.8 mg/g鲜重，显著高于其他处理。

**3.6 大豆防御相关基因表达分析**

qRT-PCR结果显示，融合赖氨酸芽孢杆菌接种显著提高了所测防御基因的转录水平，且上调幅度依赖于立枯丝核菌的存在。在融合赖氨酸芽孢杆菌处理并受病原菌挑战的植株中，叶片和根系的PR-1、PR-2、PR-10和PR-12转录水平均达到最高。其中，PR-1和PR-12在诱导处理中上调最为显著，而PR-10基因在病原菌侵染条件下被融合赖氨酸芽孢杆菌强烈诱导。

**3.7 田间条件下融合赖氨酸芽孢杆菌对立枯丝核菌发病率的影响**

在两个生长季的田间试验中，融合赖氨酸芽孢杆菌处理将出苗前立枯病发生率分别降低至5.6%和6.2%，出苗后立枯病发生率降低至2.3%和2.6%，显著低于未处理对照。病害控制效果与化学杀菌剂噻菌灵处理相当，植株存活率显著提高。

**3.8 田间条件下融合赖氨酸芽孢杆菌对大豆产量参数的影响**

融合赖氨酸芽孢杆菌处理显著提高了大豆产量构成因素。与未处理对照相比，生防菌处理使株高增加至92.8和94.0 cm（两个季节），分枝数增加至4.2和4.4，单株荚数增加至79.5和80.1，单株种子重量增加至33.8和34.2 g，百粒重增加至19.2和19.7 g，种子产量达到0.69和0.70吨/公顷。这些指标均与化学杀菌剂处理无显著差异，但显著高于未处理对照。

**讨论与结论**

本研究从大豆根际分离获得的融合赖氨酸芽孢杆菌菌株表现出了显著的抗真菌活性，能够有效抑制立枯丝核菌的生长，并在温室和田间条件下显著降低大豆立枯病的发生。该生防菌通过多种机制发挥防病促生作用：一方面直接抑制病原菌菌丝生长，另一方面通过诱导植物防御酶活性（POD、PPO、PAL、LOX）和总酚积累，激活防御相关基因（PR-1、PR-2、PR-10、PR-12）的表达，从而增强大豆的系统抗性。田间试验表明，融合赖氨酸芽孢杆菌处理在控制病害和促进增产方面与化学杀菌剂效果相当，且更加环境友好。研究结论指出，以融合赖氨酸芽孢杆菌进行种子处理可有效降低出苗前后立枯病发生率，显著提高大豆叶绿素含量、抗氧化酶活性和植株生长量，并激活PR基因转录。该研究首次在埃及田间条件下评估了融合赖氨酸芽孢杆菌对大豆立枯丝核菌根腐病的防治效果，为开发新型生物防治制剂奠定了基础。经过进一步的毒理学和生态毒理学评价、制剂开发和多位点田间试验验证后，融合赖氨酸芽孢杆菌有望成为控制立枯丝核菌的有效生物防治候选菌株。