CHO-K1细胞来源的靶向伪狂犬病病毒的单链抗体（scFv）减轻多器官病毒血症并提高致死性感染模型中的动物存活率

《Frontiers in Microbiology》：CHO-K1 cell-derived scFv targeting pseudorabies virus ameliorates multi-organ viremia and improves animal survival in a lethal infection model

　　

伪狂犬病病毒（PRV）具有增强的毒力、增加的传播性及严重的共感染，已在全球范围内重新出现，导致养猪业遭受重大经济损失。然而，传统的Bartha-K61疫苗无法对PRV变异株提供完全保护，因此迫切需要开发新的预防和治疗策略。在此，研究人员提出了一种新型抗体构建体——PRV单链抗体片段（PRV-scFv），用于PRV抗体治疗。PRV-scFv基因通过将分离自免疫小鼠脾脏的PRV-VH和PRV-VL序列经由柔性（Gly₄Ser）₃接头连接而成。该构建体在无血清悬浮培养的CHO-K1细胞中稳定表达。基于这些发现，研究人员筛选出一个单克隆细胞系CHO-K1-PRV-scFv-2E8，其可稳健表达PRV-scFv抗体，在体外有效抑制PRV感染，在体内降低病毒载量，并提高感染小鼠的存活率，这为抗体治疗和兽医治疗策略的开发提供了新见解。

**论文解读：基于CHO-K1细胞表达的PRV-scFv抗体的抗伪狂犬病病毒效应研究**

**一、研究背景与问题**

伪狂犬病（PR）是由伪狂犬病病毒（PRV）引起的一种急性传染病，PRV属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科水痘病毒属，为线性双链DNA病毒，基因组约143 kb。自20世纪70年代Bartha-K61基因缺失弱毒疫苗引入以来，我国PRV的传播得到有效控制。然而，自2011年以来，PRV变异株在我国多个猪场重新出现，其特点是毒力增强、传播范围扩大、共感染严重，且现有疫苗（包括Bartha-K61）无法提供完全保护，严重阻碍了国家伪狂犬病根除计划。此外，有证据表明某些PRV变异株可能与人类罕见感染相关，引发公共卫生担忧。传统疫苗开发周期长、依赖感染性病毒、存在生物安全风险及毒力回复或免疫不全等问题。因此，迫切需要开发新型预防和治疗策略。单链抗体片段（scFv）作为一种基因工程抗体，由重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过肽接头连接而成，具有分子量小、组织穿透能力强、免疫原性低等优势，在抗病毒治疗领域展现出良好前景。

**二、研究目标与设计**

该研究旨在构建并鉴定一种在CHO-K1细胞中表达的PRV特异性scFv抗体，并评估其体外和体内抗病毒效力。具体策略为：利用灭活的Bartha-K61弱毒株免疫BALB/c小鼠，从小鼠脾脏中克隆PRV-VH和PRV-VL基因，通过（Gly₄Ser）₃柔性接头连接构建PRV-scFv真核表达载体，在CHO-K1悬浮培养细胞中表达并筛选高分泌细胞株，最终通过体外中和试验和小鼠致死性感染模型评估其抗病毒活性。

**三、主要关键技术方法**

研究人员采用以下关键技术方法：（1）动物免疫与抗体检测：使用灭活Bartha-K61弱毒株皮下和肌肉注射免疫BALB/c小鼠，通过ELISA检测血清中PRV特异性gB抗体；（2）基因克隆与系统发育分析：从免疫小鼠脾脏提取总RNA，RT-PCR扩增PRV-VH和PRV-VL基因，克隆至pMD18-T载体测序，利用MEGA 5.10软件构建邻接法系统发育树；（3）真核表达载体构建与细胞转染：将筛选的VH和VL基因连接至pcDNA3.1(+)-C-6His载体，通过Lonza 4D-Nucleofector电穿孔转染CHO-K1-S40悬浮细胞，经G418筛选和有限稀释法获得单克隆细胞株；（4）补料分批培养：结合CB5补料培养基和葡萄糖策略延长细胞培养周期，提高重组蛋白产量；（5）蛋白纯化与鉴定：采用Vivaflow?超滤系统浓缩和Ni亲和层析纯化，BCA法测定浓度，HRP标记ELISA检测特异性结合；（6）体外中和试验：MTT法检测细胞毒性，TCID₅₀法测定病毒滴度，Western blot检测病毒蛋白表达；（7）小鼠致死性感染模型：设置预防组和治疗组，通过眶后注射给予PRV-scFv-2E8蛋白，攻毒后监测存活率、体重变化，qPCR和TCID₅₀评估脑组织和血清中病毒载量。样本队列来源：BALB/c小鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所。

**四、研究结果**

**3.1 PRV-VH和PRV-VL基因的分离与鉴定**
通过四次免疫后，ELISA检测到所有实验组小鼠血清中均存在PRV特异性gB抗体。PCR扩增获得约350 bp的PRV-VH和PRV-VL基因片段，BLAST分析显示与已知序列99%同源。系统发育分析表明，14个PRV-VH序列与NCBI数据库中OZ390817.1和AB160685.1相似，15个PRV-VL序列与JX420690.1和M36238.1相似，成功获得了抗体可变区基因。

**3.2 PRV-VH/PRV-VL真核表达载体的构建与表达**
将3个PRV-VH基因和3个PRV-VL基因分别克隆至pcDNA3.1(+)-C-6His载体，双酶切验证正确。转染CHO-K1细胞后，Western blot检测发现PRV-VH-1、PRV-VH-2和PRV-VL-3蛋白在细胞上清和裂解物中均有分泌，而PRV-VH-3、PRV-VL-1和PRV-VL-2仅在细胞裂解物中检测到，表明不同可变区基因的分泌效率存在差异。

**3.3 PRV-scFv蛋白的设计与生成**
将分泌型PRV-VH和PRV-VL基因通过（Gly₄Ser）₃接头融合，构建PRV-scFv真核表达载体。酶切验证显示约786 bp和813 bp的片段。在CHO-K1悬浮细胞中成功分泌约35 kDa的融合蛋白。通过有限稀释法筛选出21个单克隆细胞系，其中PRV-scFv-2E8表达水平最高。经20代连续传代培养，该细胞系仍稳定分泌融合蛋白，证明其遗传稳定性。

**3.4 补料分批培养对工程细胞系生长和蛋白表达的影响**
采用葡萄糖和CB5补料策略，实验组细胞培养时间比对照组延长5天，且PRV-scFv-2E8蛋白产量显著提高。说明合理的营养补充策略不仅能维持细胞活力，还能增强重组蛋白的累积产量。

**3.5 PRV-scFv-2E8蛋白的纯化与浓度测定**
通过超滤浓缩和Ni亲和层析纯化，250 mM咪唑洗脱组分获得最高产量。纯化后蛋白浓度达2.6 mg/mL。HRP标记后ELISA检测显示该蛋白能特异性结合PRV抗原。

**3.6 PRV-scFv-2E8蛋白体外有效中和PRV感染**
MTT试验显示，不同浓度PRV-scFv-2E8蛋白处理BHK-21细胞24 h后细胞活力保持在80%以上，无显著细胞毒性。TCID₅₀中和试验表明，与阳性对照组（7.225 log₁₀ TCID₅₀/mL）相比，100 μg和300 μg蛋白处理组病毒滴度分别降至6.338和5.817 log₁₀ TCID₅₀/mL，呈剂量依赖性中和效应。Western blot显示300 μg蛋白处理后抗PRV条带强度显著减弱，显微镜观察证实蛋白处理减少了PRV诱导的细胞病变效应（CPE）。

**3.7 PRV-scFv-2E8蛋白抑制组织中PRV增殖并挽救致死性感染小鼠**
在预防和治疗两种给药方案中，PRV-scFv-2E8蛋白均显著提高了感染小鼠的存活率。未处理感染组出现明显体重下降，而100 μg或300 μg处理的预防组和治疗组在7天后体重无明显变化。qPCR和TCID₅₀结果显示，治疗组脑组织和血清中PRV病毒载量均显著低于未处理感染组，表明该蛋白在体内具有高效抗病毒活性。

**五、讨论与结论**

本研究表明，PRV-scFv-2E8蛋白在体外能有效阻断PRV感染，在体内能降低病毒载量并提高存活率。其优势在于：scFv分子量小、组织穿透力强，可跨越组织或血管屏障到达病灶部位；CHO细胞表达系统可实现高水平蛋白表达、适当的翻译后修饰和正确折叠，产物具有更接近天然的生物活性。然而，研究也存在局限性：首先，scFv在小鼠中的保护效力需在猪等靶动物中进一步验证；其次，感染抑制试验无法完全阐明抗体介导的中和作用的分子机制，需进行表位定位、结合亲和力分析及抗体对病毒复制周期各阶段影响的研究；第三，目前尚无基于抗体片段的抗病毒生物药物获批，但相关研发工作正在积极推进。

研究结论：研究人员从免疫小鼠脾脏中分离出PRV-VH和PRV-VL基因，通过（Gly₄Ser）₃接头连接形成PRV-scFv，并在无血清悬浮培养的CHO-K1细胞中实现稳定表达。筛选出的单克隆细胞系CHO-K1-PRV-scFv-2E8表现出高表达水平，该抗体在体外有效阻断PRV感染，在体内降低病毒载量并提高感染小鼠存活率，展示了其抗病毒应用潜力。这些结果引入了PRV抗体治疗的有前景的候选抗体，为兽医抗体治疗方案的开发提供了见解。该研究发表于《Frontiers in Microbiology》。