细胞链形成在单核细胞增生李斯特菌divIVA突变体减毒中的作用

《Virulence》：On the role of cell chaining in the attenuation of a Listeria monocytogenes divIVA mutant

　　

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种人类病原体，可入侵非吞噬宿主细胞，在其胞质溶胶内复制，并直接在细胞间传播。这些过程由特异性毒力因子介导，但也依赖于DivIVA蛋白（一种参与细胞分裂的保守蛋白）。DivIVA在需要辅助分泌ATP酶SecA2（accessory secretion ATPase SecA2）的过程中促进肽聚糖降解自溶素（peptidoglycan-degrading autolysins）的分泌，从而促进胞质分裂后的子代细胞分离。因此，ΔdivIVA突变体形成未分离子代细胞的长链，这可能解释其毒力减弱。为进一步探索细胞链形成在减毒中的作用，研究人员在此研究了不同形态异常如何影响单核细胞增生李斯特菌的毒力。研究人员生成了球菌状mreB突变体和丝状ezrA突变体，并在不同体外感染试验中将其与ΔdivIVA突变体进行比较。与ΔdivIVA突变体的细胞链形成不同，球菌状或丝状形态并不损害宿主细胞入侵或胞内复制。引入PrfA毒力调控因子（PrfA virulence regulator）的超活性等位基因，导致毒力基因组成性过表达，足以恢复ΔdivIVA突变体的入侵缺陷，尽管其具有明显的细胞链形成表型，但并未恢复胞内复制。研究人员分离了携带secA2突变的ΔdivIVA突变体抑制子，这些突变可能增强SecA2 ATP酶活性。在这些抑制子中，自溶素分泌、子代细胞分离和入侵完全恢复，胞内复制部分恢复。因此，维持正常杆状形态在单核细胞增生李斯特菌致病过程中发挥次要作用；相反，ΔdivIVA突变体的毒力减弱更好地由PrfA和SecA2依赖性过程的紊乱来解释。

论文解读：细胞链形成在单核细胞增生李斯特菌divIVA突变体减毒中的作用

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性食源性病原体，可在老年人和免疫低下个体中引起严重感染，病死率高达30%。该菌从环境中的腐生生活方式转变为进入宿主后的致病状态，激活毒力因子并适应性调节代谢和细胞分裂。中央转录因子PrfA在感染期间激活毒力基因表达，其调控子包括内化素（internalins）以及LIPI-1毒力岛中的溶血素、磷脂酶和ActA等因子。除这些经典毒力因子外，细菌的胞内生活也依赖管家蛋白如DivIVA。DivIVA是革兰氏阳性菌中保守的晚期细胞分裂蛋白，结合细胞极和分裂隔膜，参与细胞分裂、孢子形成、群集运动等多种过程。在单核细胞增生李斯特菌中，ΔdivIVA突变体因不能分泌肽聚糖降解自溶素CwhA（p60）和NamA而无法完成子代细胞分离，形成长链，并丧失入侵、胞内复制和细胞间传播能力。以往观点认为链形成是毒力减弱的主要原因，但缺乏直接证据。因此，研究人员系统比较了不同形态异常突变体的毒力，以阐明细胞链形成在减毒中的具体作用。

研究人员利用IPTG诱导型启动子构建了MreB和EzrA耗竭菌株，分别产生球菌和丝状形态，并与ΔdivIVA链状突变体比较。使用人类HepG2肝细胞（ATCC HB-8065）、J774小鼠巨噬细胞（ATCC TIB-67）和3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞（ATCC CL-173）进行体外感染试验，包括入侵测定、胞内复制测定、蚀斑试验和荧光显微术。还采用扫描电镜观察超微结构，全基因组测序鉴定抑制子突变，等位基因交换构建定点突变菌株，SDS-PAGE分泌蛋白组分析检测自溶素分泌，CAMP试验和卵黄平板测定溶血/磷脂酶活性，软琼脂试验测定运动性。

结果方面，首先，单核细胞增生李斯特菌divIVA、ezrA和mreB突变体具有不同的形态表型。研究人员成功构建MreB耗竭菌株（imreB）和EzrA耗竭菌株（iezrA）。MreB耗竭导致细胞完全失去杆状形态变为球菌；EzrA耗竭导致严重丝状化，平均细胞长度约12.7微米，而野生型仅1.5微米；ΔdivIVA形成平均约15个细胞的长链。扫描电镜显示ΔdivIVA细胞表面有小泡样结构，部分区域弯曲或卷曲；MreB耗竭细胞表面呈现光滑区与颗粒区；EzrA耗竭细胞则未见这些特征。

其次，divIVA、ezrA和mreB突变的组合。在ΔdivIVA背景下耗竭MreB产生链状球菌，耗竭EzrA产生丝状链，两者均出现细胞裂解迹象，因此未纳入进一步分析。

第三，形态异常对宿主细胞入侵、胞内生长和细胞间传播的影响。HepG2入侵试验中，ΔdivIVA入侵率较野生型降低约15倍，而MreB或EzrA耗竭不降低入侵率。J774巨噬细胞胞内复制试验中，ΔdivIVA无法在胞内生长，而MreB或EzrA耗竭不影响胞内细菌数量。蚀斑试验中，DivIVA和MreB耗竭完全阻止蚀斑形成，EzrA耗竭仅减小蚀斑尺寸。肌动蛋白尾形成试验中，ΔdivIVA无肌动蛋白尾形成，MreB或EzrA耗竭则很少形成尾，但仍可观察到肌动蛋白包被。

第四，PrfA激活抑制ΔdivIVA入侵缺陷。研究人员将组成性激活的prfA*等位基因引入ΔdivIVA突变体，该菌株溶血和磷脂酶活性升高，但仍形成细胞链。该菌株入侵HepG2细胞的能力完全恢复，甚至达到prfA*单突变体的高水平，但胞内复制缺陷和蚀斑缺陷未恢复。这表明入侵缺陷涉及PrfA依赖性过程，而胞内复制和细胞间传播缺陷不依赖PrfA。

第五，SecA2激活抑制ΔdivIVA胞内复制缺陷。研究人员从ΔdivIVA菌苔中分离出两个平滑抑制子ssd1和ssd2。全基因组测序发现ssd1携带secA2 M95I突变，ssd2携带secA2 T123A突变（另有其他突变）。这些突变位于SecA2核苷酸结合域，可能增强其ATP酶活性。在ΔdivIVA背景下重新引入这些突变，恢复自溶素CwhA分泌和子代细胞分离，完全恢复入侵能力，部分恢复胞内复制，但未能恢复运动性和蚀斑形成。这表明DivIVA还具有独立于PrfA和SecA2的关键毒力功能。

讨论部分指出，细胞链形成本身不能解释ΔdivIVA的毒力缺陷。EzrA耗竭产生的长丝体长度与ΔdivIVA链相当，但仍能传播；prfA*链状菌仍高效入侵，说明颗粒长度并非决定因素。ΔdivIVA的胞内复制缺陷对prfA*呈显性，表明该缺陷独立于PrfA；secA2突变部分恢复复制，提示DivIVA可能激活SecA2的ATP酶活性。ΔdivIVA胞内部分被肌动蛋白包被，表明其能到达宿主胞质，但复制缺陷原因可能涉及吞噬体逃逸延迟、自噬降解、营养缺陷或表面蛋白功能异常。未来需进一步研究DivIVA激活SecA2的分子机制。

结论部分可翻译为：因此，维持正常杆状形态在单核细胞增生李斯特菌的致病过程中作用次要；相反，ΔdivIVA突变体的毒力减弱更好地由PrfA和SecA2依赖性过程的紊乱来解释。