补体C3抑制肽AMY-101在NMOSD小鼠模型中改善脑损伤

《Annals of Medicine》：Complement C3 inhibitory peptide AMY-101 ameliorates brain injury in a mouse model of NMOSD

　　

背景：视神经脊髓炎谱系疾病（neuromyelitis optica spectrum disorder, NMOSD）是一种中枢神经系统（central nervous system, CNS）的自身免疫性炎症性脱髓鞘疾病，临床主要表现为视神经炎和横贯性脊髓炎。本研究旨在探讨补体C3抑制肽AMY-101在NMOSD实验模型中的治疗潜力。方法：体外实验采用AQP4转染的细胞暴露于AQP4-IgG和人补体（human complement, hC），以评估补体依赖性细胞毒性（complement-dependent cytotoxicity, CDC）和膜攻击复合物（membrane attack complex, MAC）沉积。体内疗效通过NMOSD脑内注射小鼠模型进行评估，比较AMY-101治疗组与未治疗对照组之间的组织病理学变化。结果：AMY-101显著减轻了AQP4-IgG和hC介导的细胞毒性，并在体外抑制了MAC形成。在NMOSD小鼠模型中，与对照组相比，AMY-101治疗显著减少了星形胶质细胞丢失、AQP4缺失和脱髓鞘。结论：这些发现表明，使用AMY-101抑制补体C3可有效改善NMOSD实验模型中的关键病理特征，支持其作为治疗策略的潜力，并为进一步的临床前和临床研究提供了依据。

**论文解读**

**研究背景与问题**
视神经脊髓炎谱系疾病（neuromyelitis optica spectrum disorder, NMOSD）是一种严重的中枢神经（central nervous system, CNS）自身免疫性炎症性脱髓鞘疾病，临床以视神经炎和横贯性脊髓炎为主要表现。约90%的未治疗患者在3年内复发，导致进行性残疾。患者血清中针对星形胶质细胞水通道蛋白-4（aquaporin-4, AQP4）的自身抗体（AQP4-IgG）是核心致病因子：AQP4-IgG与星形胶质细胞上的AQP4结合后，激活补体级联反应，形成膜攻击复合物（membrane attack complex, MAC），引发星形胶质细胞损伤、脱髓鞘和神经元丢失。当前治疗包括免疫抑制剂、血浆置换和靶向生物制剂（如eculizumab、satralizumab、inebilizumab、rituximab），其中补体C5抑制剂eculizumab已获批用于AQP4-IgG阳性成人NMOSD患者，但单克隆抗体存在分子量大、CNS分布有限、免疫原性（如人抗鼠抗体）等局限。近年来，基于肽的补体抑制剂因其低分子量和低免疫原性潜力受到关注。AMY-101（1.789 kDa）是一种源自第三代compstatin类似物Cp40的新型补体靶向治疗肽，对补体C3具有高亲和力和选择性（Kd = 0.5 nm），可皮下注射且在临床研究中显示安全性和耐受性。本研究旨在探讨AMY-101在NMOSD实验模型中的治疗潜力，验证补体C3抑制作为治疗策略的可行性。该论文发表在《Annals of Medicine》。

**关键技术与方法**
研究人员采用以下主要技术方法：（1）体外实验：使用慢病毒包装构建稳定过表达M23-AQP4的中华仓鼠卵巢（CHO）细胞（AQP4-CHO），从两名AQP4-IgG强阳性NMOSD患者（分别于2023年11月5日和2023年12月23日采集血清）及年龄性别匹配的健康对照中纯化总IgG，通过LIVE/DEAD活力/细胞毒性试剂盒评估补体依赖性细胞毒性（complement-dependent cytotoxicity, CDC），免疫荧光染色检测C5b-9（MAC标志物）沉积。（2）体内实验：采用C57BL/6雌性小鼠（8-10周龄，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司）建立脑内注射NMOSD模型，将IgG_NMOSD、人补体（human complement, hC）及AMY-101或PBS共注射至右侧纹状体，7天后取脑进行冰冻切片，免疫荧光染色检测AQP4、GFAP（星形胶质细胞标志物）和MBP（髓鞘标志物）的丢失面积，使用ImageJ软件定量，两组间比较采用双侧Mann–Whitney U检验。

**研究结果**

**AMY-101在体外预防AQP4-IgG介导的补体依赖性细胞毒性**
通过慢病毒转导，AQP4-CHO细胞稳定表达M23-AQP4，而空载体对照（null-CHO）不表达。将AQP4-CHO细胞与10% NMOSD患者血清（serum_NMOSD）或对照血清孵育30分钟，再加入5% hC及AMY-101或对照肽。LIVE/DEAD染色显示，serum_NMOSD诱导了AQP4-CHO细胞的CDC，但AMY-101显著降低了细胞死亡比例（p = 0.0079），而null-CHO细胞无此效应。

**AMY-101的保护作用依赖于hC浓度并抑制MAC形成**
将AQP4-CHO细胞与10% serum_NMOSD和不同浓度hC（2.5%、5%、10%、15%）及0.5 mM AMY-101孵育，结果显示死细胞比例随hC浓度升高而增加；固定hC浓度，AMY-101的EC50随hC增加而升高，表明保护作用依赖hC浓度。C5b-9免疫荧光染色显示，serum_NMOSD加hC处理后，细胞膜上出现大量C5b-9沉积，而AMY-101处理显著降低了C5b-9阳性细胞比例（29.080% ± 6.725% vs 77.820% ± 6.635%，p = 0.0079），证实AMY-101抑制了MAC形成。

**AMY-101不影响AQP4-IgG与AQP4的结合**
将AQP4-CHO细胞与不同浓度serum_NMOSD（5%、10%、15%、20%）、固定浓度hC（5%）和AMY-101（0.5 mM）孵育，死细胞比例约50%，AMY-101的EC50未变。使用两种不同患者血清进行免疫荧光染色，高浓度AMY-101（2 mM）不影响AQP4-IgG与AQP4的结合，提示保护作用独立于AQP4-IgG结合。

**AMY-101减轻NMOSD小鼠模型中的脑损伤**
在脑内注射小鼠模型中，注射IgG_NMOSD和hC后7天，免疫荧光染色显示AQP4、GFAP和MBP显著丢失（即NMOSD样病变）。AMY-101共注射组与对照组相比，AQP4丢失面积（1.782 ± 0.287 vs 2.640 ± 0.287 mm²，p = 0.0079）、GFAP丢失面积（1.143 ± 0.291 vs 1.927 ± 0.179 mm²，p = 0.0079）和MBP丢失面积（0.884 ± 0.196 vs 1.558 ± 0.115 mm²，p = 0.0079）均显著减少，表明AMY-101有效减轻了星形胶质细胞丢失、AQP4缺失和脱髓鞘。

**讨论与结论**
讨论部分指出，NMOSD是一种严重CNS自身免疫性炎症疾病，补体激活在AQP4-IgG阳性发病中起核心作用。AMY-101通过抑制C3阻断补体级联反应，不仅减少MAC形成，还可能影响调理作用、过敏毒素生成和补体放大效应，但本研究主要聚焦于AQP4-IgG和补体介导的损伤及MAC沉积，未明确下游通路的相对贡献。与eculizumab（抗C5单克隆抗体）相比，AMY-101作为小分子肽（13个氨基酸）可能具有低免疫原性和潜在更好的CNS穿透性，但其CNS穿透能力和长期免疫原性需进一步验证。研究局限性包括：样本量较小（每组5只小鼠，但符合既往探索性研究规模）；脑内注射模型不能完全模拟NMOSD的全部机制（如外周免疫激活、血脑屏障功能障碍、慢性病程、适应性免疫反应和全身补体动力学）；血脑屏障穿透性和免疫原性未在实验中评估。未来需在被动转移和慢性NMOSD模型中进行验证。

**结论**
AMY-101在体外和体内NMOSD模型中有效抑制了AQP4-IgG和人补体介导的损伤。作为一种C3抑制肽，AMY-101可能具有低免疫原性和改善CNS暴露的潜在药理学优势，但这些特性需在后续研究中进一步验证。综上所述，研究人员的发现为AMY-101在NMOSD中的治疗潜力提供了临床前证据，并强调了补体C3抑制作为该疾病一种有前景且可转化的治疗策略。