二氢杨梅素对牙龈卟啉单胞菌表现出强效抗菌活性和毒力因子抑制效应

《Frontiers in Oral Health》：Dihydromyricetin exhibits potent antibacterial activity and virulence factor inhibitory effects against Porphyromonas gingivalis

　　

摘要目的：二氢杨梅素（DMY）对多种病原菌具有抑制作用，但其对牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）的作用尚不清楚。本研究探讨DMY对浮游态牙龈卟啉单胞菌、生物膜及相关毒力因子的影响，评估DMY体外抗牙龈卟啉单胞菌的抗菌活性，并初步探索其可能的抗菌机制。方法：采用微量稀释法探究DMY对浮游态牙龈卟啉单胞菌的抑制作用。通过结晶紫染色评估DMY对生物膜形成的影响。利用qRT-PCR检测其对菌毛基因（fimA、fimR、fimS）和荚膜多糖基因PGN-1525表达的影响。通过蛋白质底物分析法评估DMY对牙龈素（精氨酸蛋白酶和赖氨酸蛋白酶）蛋白水解活性的影响。结果：1% DMSO对牙龈卟啉单胞菌的生长无显著影响。DMY对浮游态牙龈卟啉单胞菌的最低抑菌浓度（MIC）为160?μg/mL，最低杀菌浓度（MBC）为320?μg/mL。160–640?μg/mL的DMY可下调菌毛基因（fimA、fimR、fimS）和荚膜多糖基因（PGN_1525）的表达；40–160?μg/mL的DMY以浓度依赖方式抑制Rgp和Kgp的蛋白水解活性。结论：二氢杨梅素对牙龈卟啉单胞菌表现出相对显著的抗菌活性和毒力因子抑制作用。

**论文解读：二氢杨梅素对牙龈卟啉单胞菌的抗菌及抗毒力作用研究**

**1. 研究背景与问题**

慢性牙周炎是一种常见的炎症破坏性牙周疾病，牙龈卟啉单胞菌（*Porphyromonas gingivalis*, *P. gingivalis*）是其最主要的致病菌之一。该菌长期定植于口腔，通过菌毛、牙龈素（gingipains）和荚膜等多种毒力因子的协同作用形成生物膜，直接侵袭并破坏牙周组织，同时触发宿主过度的免疫炎症反应，与其他口腔病原菌共同促进慢性牙周炎的发生发展。因此，通过抗菌疗法清除*P. gingivalis*或减弱其毒力，是临床治疗慢性牙周炎的重要途径之一。

目前，临床治疗慢性牙周炎主要依赖牙周基础治疗和牙周手术治疗，但部分感染部位难以用器械完全触及，且口腔其他部位的微生物可能再次侵入牙周组织或重新定植于牙周袋。因此，临床上常辅以抗菌药物治疗，尤其对于患有全身性疾病或无法有效管理口腔卫生的患者。然而，传统抗菌药物（如硝基咪唑类、四环素类、β-内酰胺类、大环内酯类）因耐药性问题日益突出，其疗效受限。研究表明，*P. gingivalis*对多种抗生素的敏感性已下降。在此背景下，寻找更有效的抗菌药物或活性成分迫在眉睫。天然植物提取物因其来源广泛、成本低廉、对人体副作用小、不易诱导耐药性等优势，展现出广阔的应用前景。

藤茶作为一种传统中草药，其主要活性成分为二氢杨梅素（Dihydromyricetin, DMY），这是一种植物源黄酮类化合物。已有研究证实DMY对多种常见病原菌（如副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等）具有广谱抗菌活性，其机制涉及破坏细菌膜通透性、升高胞内活性氧水平、抑制代谢酶及干扰核酸复制。然而，DMY对*P. gingivalis*的作用尚不清楚。因此，本研究旨在评估DMY对浮游态和生物膜态*P. gingivalis*的抑制作用，分析其对相关毒力因子的影响，并初步探索其可能的抗菌机制，为开发治疗慢性牙周炎的新药提供实验依据。该论文发表在《Frontiers in Oral Health》。

**2. 关键技术方法**

研究人员为开展本研究，主要采用了以下关键技术方法：
- **微量稀释法**：用于评估DMY对浮游态*P. gingivalis*（标准株ATCC 33277）的抑制作用，确定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。
- **结晶紫染色法**：用于定量检测DMY对*P. gingivalis*生物膜形成（抑制）和成熟生物膜（清除）的影响，计算最小生物膜抑制浓度（MBIC₅₀、MBIC₉₀）和最小生物膜清除浓度（MBEC₅₀）。
- **实时荧光定量PCR（qRT-PCR）**：用于检测DMY对*P. gingivalis*菌毛相关基因（*fimA*、*fimR*、*fimS*）和荚膜多糖基因（*PGN_1525*）表达水平的影响，以16S rRNA为内参基因，采用2^?△△Ct法计算相对表达量。
- **蛋白质底物分析法**：用于评估DMY对*P. gingivalis*牙龈素（精氨酸蛋白酶Rgp和赖氨酸蛋白酶Kgp）蛋白水解活性的直接影响。

**3. 研究结果**

**3.1 不同浓度DMSO对*P. gingivalis*的影响**
通过微量稀释法结合光密度（OD）值测量发现，1% DMSO对*P. gingivalis*的生长无显著影响（*P* > 0.05），而1.5%和2% DMSO则显著抑制其生长（*P* < 0.05）。因此，后续实验选用1% DMSO作为DMY的溶剂。

**3.2 DMY对浮游态*P. gingivalis*和生物膜的影响**

**3.2.1 DMY对浮游态*P. gingivalis*的影响**
采用微量稀释法结合肉眼观察和OD₆₀₀值测定，结果显示DMY能有效抑制浮游态*P. gingivalis*的生长。其MIC为160?μg/mL，MBC为320?μg/mL，表明DMY在相对较低浓度下即可抑制*P. gingivalis*生长，并在较高浓度下达到杀菌效果。

**3.2.2 DMY对*P. gingivalis*生物膜的影响**
- **对生物膜形成的影响**：通过结晶紫染色法测定，DMY能够以浓度依赖方式有效抑制*P. gingivalis*生物膜的形成。与对照组相比，80?μg/mL及以上浓度的DMY显著降低生物膜总量（*P* < 0.001）。MBIC₅₀为160?μg/mL，MBIC₉₀为320?μg/mL。
- **对成熟生物膜的清除作用**：DMY对已形成的成熟*P. gingivalis*生物膜同样具有清除效果。160?μg/mL至640?μg/mL的DMY能显著减少成熟生物膜量（*P* < 0.01），且呈浓度依赖性。MBEC₅₀为320?μg/mL，表明成熟生物膜对DMY的抵抗力强于新生生物膜。

**3.3 DMY对*P. gingivalis*毒力因子的影响**

**3.3.1 DMY对菌毛基因（*fimA*、*fimR*、*fimS*）和荚膜多糖基因（*PGN_1525*）表达的影响**
通过qRT-PCR检测发现，DMY以浓度依赖方式下调*P. gingivalis*菌毛结构基因（*fimA*）和调控基因（*fimR*、*fimS*）以及荚膜多糖基因（*PGN_1525*）的mRNA表达水平。在160–640?μg/mL浓度范围内，各基因的相对表达量降低超过50%，达到具有生物学意义的抑制标准（*P* < 0.05）。

**3.3.2 DMY对牙龈素蛋白水解活性的影响**
通过蛋白质底物分析法测定，40–160?μg/mL的DMY能够以浓度依赖方式显著抑制Rgp和Kgp的蛋白水解活性（*P* < 0.001）。该实验直接验证了DMY对已分泌至胞外的牙龈素酶的抑制作用，而非调控其合成。

**4. 讨论与结论总结**

讨论部分指出，DMY作为一种天然黄酮类化合物，对*P. gingivalis*展现出多靶点、多维度的协同作用：①直接抑制浮游菌生长（MIC=160?μg/mL，MBC=320?μg/mL）；②双重作用于生物膜，既抑制新生生物膜形成（MBIC₅₀=160?μg/mL，MBIC₉₀=320?μg/mL），又清除成熟生物膜（MBEC₅₀=320?μg/mL）；③通过转录水平下调菌毛相关基因（*fimA*、*fimR*、*fimS*）和荚膜多糖基因（*PGN_1525*）的表达，阻碍菌毛和荚膜的合成；④直接抑制胞外牙龈素（Rgp、Kgp）的蛋白水解活性，减少宿主组织降解。此外，DMY的MIC值与已知对其他常见病原菌的MIC范围（金黄色葡萄球菌32–128?μg/mL，大肠杆菌128–256?μg/mL）相比，属于中等敏感范围，表明*P. gingivalis*对DMY并无特殊的内在耐药性。

研究结论部分翻译如下：本研究结果表明，DMY对浮游态和生物膜态的*P. gingivalis*均表现出显著的抗菌活性。它不仅能抑制浮游态*P. gingivalis*的增殖，还能有效抑制其生物膜的形成并清除成熟生物膜。此外，DMY能显著下调*P. gingivalis*菌毛相关基因（*fimA*、*fimR*、*fimS*）和荚膜多糖基因（*PGN_1525*）的表达水平，并抑制牙龈素Rgp和Kgp的蛋白水解活性。DMY有望成为一种新型的植物源抗菌剂或抗菌活性成分，用于*P. gingivalis*感染控制和牙周疾病的防治。未来仍需进一步的深入机制研究以及体内外验证，以完善这一结论并为临床应用提供依据。