《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Combined treatment of spinal cord injury using channeled Porous-GelMA scaffold loaded with genetically engineered MSCs expressing inducible ChABC and constitutive BDNF
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目的：脊髓损伤（SCI）后，由硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）介导的胶质瘢痕形成，加之神经营养支持不足，阻碍了轴突再生。此外，急性期损伤部位缺乏物理支撑，影响细胞存活和植入。为应对这些挑战，研究人员开发了一种三维通道化多孔GelMA支架（CPGS），该支架提供
目的：脊髓损伤（SCI）后，由硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）介导的胶质瘢痕形成，加之神经营养支持不足，阻碍了轴突再生。此外，急性期损伤部位缺乏物理支撑，影响细胞存活和植入。为应对这些挑战，研究人员开发了一种三维通道化多孔GelMA支架（CPGS），该支架提供空间引导和结构支撑。该支架与基因工程化间充质干细胞（MSCs）整合，这些细胞被设计为持续释放脑源性神经营养因子（BDNF）并诱导表达硫酸软骨素酶ABC（ChABC）。该整合系统结合了治疗因子、干细胞和组织工程，以改善损伤微环境并促进SCI后的神经再生。方法：对MSCs进行基因工程改造，使其持续表达BDNF并实现多西环素（Dox）诱导的ChABC表达。采用RT-qPCR和Western blotting验证表达水平。研究人员进行了转录组学分析和蛋白质水平验证，以评估关键信号通路的激活。制备了具有纵向引导线索的多孔GelMA基CPGS，并对其结构和力学性能进行了表征。随后将BDNF/ChABC-MSCs接种到CPGS中构建整合系统，并在大鼠SCI模型中进行了评估。结果：BDNF/ChABC-MSCs成功表达了BDNF和Dox诱导型ChABC，导致mTOR、Hedgehog、FAK和MAPK信号通路激活，这一结果通过转录组学分析得到证实，并在蛋白质水平得到确认。CPGS表现出纵向引导和良好的力学性能。体内研究表明，BDNF/ChABC-MSCs–CPGS系统显著改善了BBB评分，明显减小了病变面积和胶原沉积，降低了CS-56表达，并增加了轴突再生标志物NF-H和GAP43的表达。结论：BDNF/ChABC-MSCs–CPGS整合系统通过结构引导和生化调节增强SCI病变微环境，从而促进轴突再生和功能恢复。该策略为SCI治疗中的组织工程与干细胞治疗联合提供了一种新方法。
**脊髓损伤修复的整合策略：BDNF/ChABC-MSCs-CPGS系统的研究解读**
**一、研究背景与科学问题**
脊髓损伤（SCI）是中枢神经系统损伤中最具破坏性的类型之一，常导致损伤平面以下持久的运动和感觉功能障碍，严重威胁患者的生活质量。SCI后的神经再生面临多重障碍，其中最具挑战性的是损伤部位形成的抑制性微环境。这一微环境的特征包括：反应性星形胶质细胞分泌硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）并在细胞外基质（ECM）中沉积，构成胶质瘢痕的主要成分，形成阻碍轴突延伸的物理和分子屏障；同时，损伤脊髓区域的神经营养支持不足，限制了神经元存活和突触连接的恢复。因此，减轻瘢痕形成后的抑制性基质沉积并确保充足的神经营养支持，被认为是SCI修复的关键策略。
在现有治疗策略中，间充质干细胞（MSCs）因其旁分泌特性和免疫调节功能被广泛研究，可作为治疗因子的细胞载体。然而，MSCs单独移植在SCI病灶中面临细胞存活率受限、植入效率欠佳和结构引导不足等问题。组织工程支架能够为细胞治疗提供机械支撑和明确的三维结构，可改善细胞滞留和移植效率，同时为再生轴突提供物理引导线索。然而，现有支架制备策略仍面临诸多限制，如软水凝胶结构的机械稳定性不足、增材制造工艺依赖性限制、电纺导管在纤维直径、孔隙率和排列方面的变异性等。因此，开发一种兼具结构引导功能和良好力学性能的支架，并将其与基因工程化MSCs相结合，成为SCI修复的重要研究方向。
**二、研究设计与技术方法**
为应对上述挑战，研究人员开发了一种三维、纵向通道化的多孔GelMA（甲基丙烯酰化明胶）支架（CPGS），采用热辅助微模板铸造策略制备，保持了通道通畅性和基质完整性。该系统整合了基因工程化MSCs，通过慢病毒转导实现BDNF的组成型表达和多西环素（Dox）诱导的ChABC表达。研究中，MSCs分离自6周龄Sprague-Dawley大鼠，所用细胞为3至10代。通过RT-qPCR和Western blotting验证了基因表达水平；利用转录组学分析和蛋白质水平验证评估了关键信号通路的激活；通过扫描电子显微镜（SEM）表征了支架微观结构，并进行了力学性能测试。在体内实验中，采用大鼠T10完全横断模型，将载有BDNF/ChABC-MSCs的CPGS植入2mm损伤间隙，并通过口服Dox诱导ChABC表达。动物分为四组：Sham组（仅椎板切除）、SCI组（完全横断）、CPGS组（植入无细胞CPGS）和BDNF/ChABC-MSCs–CPGS组（植入整合系统）。
**三、主要研究结果**
**3.1 基因工程化BDNF/ChABC-MSCs的构建**
采用Tet-On系统构建了基因工程化MSCs，该系统通过Dox添加实现靶基因表达的精确调控。研究设计了三个关键质粒：CMV-Tet3G-BDNF（组成型BDNF表达）、Tre3GV/TetO-GFP（报告基因监测转染效率）和Tre3GV/TetO-ChABC-Flag-GFP（Dox诱导的Flag标签ChABC表达）。RT-qPCR和Western blotting分析证实，BDNF/ChABC-MSCs实现了BDNF的稳定组成型表达（28kDa）和Dox诱导的ChABC高表达（约110kDa），后者与奇异变形杆菌来源的全长细菌ChABC的分子量一致。
**3.2 BDNF/ChABC-MSCs中mTOR、Hedgehog、FAK和MAPK信号通路的联合激活**
转录组学分析显示，与GFP对照组相比，BDNF/ChABC组有100个基因上调和90个基因下调，GO富集分析表明这些差异表达基因主要涉及细胞迁移、细胞分化和细胞因子活性等神经修复关键生物学过程。KEGG通路富集分析显示BDNF/ChABC组富集了ECM-受体相互作用通路。GSEA预筛选鉴定出mTOR通路（NES=1.44）和Hedgehog通路（NES=1.52）为候选通路。蛋白质水平验证确认了GLI1（Hedgehog通路末端效应蛋白）的显著上调、mTOR磷酸化水平的增加、FAK在Y397位点的磷酸化水平增加，以及MAPK通路中JNK和ERK1/2磷酸化的显著增加，而p-p38水平保持不变。
**3.3 CPGS的材料表征**
CPGS被设计为圆柱形支架（长约2.0mm，直径约3.0mm），包含19个纵向贯穿微通道（直径0.2mm），建立了直的轴向对齐引导结构。体外降解测试显示，CPGS在6周内呈现逐渐的质量损失，与传统GelMA支架的降解率无显著差异。水保留测试表明CPGS具有较高的保湿倾向。力学表征显示，10%（w/v）多孔GelMA和非多孔GelMA的压缩模量（分别约26.4kPa和26.9kPa）显著高于5%（w/v）配方（5.2kPa至8.6kPa之间），且引入孔隙率并未显著降低压缩模量。SEM确认了纵向贯穿通道和均匀多孔结构的存在，细胞接种后BDNF/ChABC-MSCs粘附于支架表面和孔内区域。
**3.4 BDNF/ChABC-MSCs-CPGS促进大鼠SCI后的功能恢复和结构再生**
体内研究表明，BDNF/ChABC-MSCs-CPGS组在BBB评分上较SCI组和单纯支架组有显著改善。H&E染色显示该组组织缺损和空洞面积更小、病变边界更连续；Masson三色染色显示胶原沉积减少、纤维化瘢痕负担减轻。免疫荧光分析显示，该组CS-56（CSPG沉积标志物）的免疫反应性显著降低，而NF-H（成熟轴突结构标志物）和GAP43（再生相关蛋白）的表达均增加，表明损伤微环境从抑制状态向更有利于再生的状态转变。
**四、讨论与结论**
本研究开发了一种整合治疗因子递送、基因工程化MSCs和组织工程结构引导的综合修复系统，旨在对损伤脊髓微环境进行互补的时空调节。在治疗因子层面，Tet-On基因系统实现了ChABC表达的精确时间控制（损伤后1周启动），避免了早期ChABC表达的潜在负面影响，同时MSCs介导BDNF的持续局部递送。在干细胞层面，双基因修饰激活了FAK、MAPK、mTOR和Hedgehog等多条关键信号通路，增强了MSCs对外部环境的响应能力和在复杂微环境中的存活适应性。在组织工程层面，CPGS通过19个纵向微通道提供精确的轴突再生方向线索，其10%多孔GelMA基质在保持力学稳定性的同时维持了通道通畅性。
研究结论指出，该BDNF/ChABC-MSCs-CPGS整合系统通过结构引导和生化调节增强SCI病变微环境，促进轴突再生和功能恢复，为SCI治疗中的组织工程与干细胞治疗联合提供了一种新策略。然而，研究也承认了若干局限性，包括缺乏全因子动物对照组以明确各组分独立作用、支架动态力学性能未充分表征、Dox诱导和ChABC分泌的体内验证不足，以及长期安全性（如GLI1上调的潜在肿瘤风险）需要在临床转化前进行系统评估。
