《Frontiers in Bioinformatics》：LungMicroHostR: an R package for integrated host–microbiome analysis of bronchoalveolar lavage fluid metagenomic sequencing data
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摘要
引言：支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）宏基因组下一代测序（metagenomic next-generation sequencing, mNGS）可从同一呼吸道标本中捕获微生物谱和宿主来源的分
摘要
引言：支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）宏基因组下一代测序（metagenomic next-generation sequencing, mNGS）可从同一呼吸道标本中捕获微生物谱和宿主来源的分子测量值，但下游分析需要协调处理低生物量微生物信号、阴性对照信息和多个特征表。方法：研究人员开发了LungMicroHostR，一个用于BALF宏基因组测序数据下游宿主-微生物组分析的R包。该包将处理后的微生物谱、宿主来源的分子测量值、样本元数据和阴性对照信息整合到统一的R工作流程中，用于特征过滤、比较模型评估、可视化和可重复报告。结果：利用公开的GSE252118资源（包含402例肺癌或肺部感染患者样本），LungMicroHostR组装了匹配的微生物、宿主和临床特征表，估计了阴性对照中的流行率，并比较了宿主转录组、微生物谱以及宿主-微生物联合模型。在测试集中，10特征宿主转录组最近质心模型实现了0.772的AUC（95%置信区间，0.680–0.860），5特征RNA微生物逻辑回归模型实现了0.745的AUC（0.655–0.832），而联合宿主转录组-RNA微生物逻辑回归模型实现了0.765的AUC（0.655–0.866），平衡准确率为0.720。此外，在mOTU水平上分析了外部PRJNA714488 BALF鸟枪法宏基因组数据集；LungMicroHostR将所得特征表与表型元数据匹配，生成了388特征×26样本的微生物丰度矩阵。讨论：LungMicroHostR为需要联合评估微生物谱、宿主来源测量值、阴性对照信息和外部微生物特征表的呼吸道宏基因组分析提供了文档化的函数。
**论文解读：LungMicroHostR——面向BALF宏基因组数据的宿主-微生物组整合分析R包**
**研究背景与问题**
支气管肺泡灌洗液（BALF）宏基因组下一代测序（mNGS）技术可同时从同一呼吸道临床标本中获取微生物核酸和宿主分子特征，极大拓展了呼吸系统疾病研究的能力。在肺癌和肺部感染研究中，处理后的BALF mNGS数据资源可包含微生物组成、宿主转录谱、免疫细胞估计、拷贝数变异（CNV）摘要和肿瘤分数估计等信息，使分析超越单纯的微生物丰度。然而，微生物与宿主来源测量值的联合分析要求可重复的工作流程，需在特征表、样本元数据和阴性对照信息之间保持连接。现有微生物组分析工具（如QIIME 2、Phyloseq、MicrobiomeAnalyst等）虽能处理分类谱和统计可视化，但BALF mNGS数据需要在一个共同工作流程中联合分析微生物谱、宿主来源分子特征、样本元数据和阴性对照信息。此外，下呼吸道标本可能含有相对于背景核酸而言较低的微生物生物量，低生物量下呼吸道材料的微生物谱可能受试剂来源DNA、交叉污染及其他背景信号影响。阴性对照为解释微生物特征提供了重要背景，尤其当低丰度分类群纳入统计分析时。集成宿主-微生物组分析进一步增加了复杂性，因为微生物丰度表、宿主转录组测量、免疫细胞估计和临床注释作为独立数据层生成，必须在统计分析前于样本水平进行匹配。已发表的研究也强调需要透明报告特征过滤、阴性对照信息和模型性能摘要。因此，有必要开发一个专门针对BALF mNGS下游分析的R包，以协调处理微生物特征表、宿主来源分子测量、样本元数据、阴性对照信息，并支持模型比较和可视化。
**研究目的与内容**
研究人员开发了LungMicroHostR，一个用于BALF mNGS宿主-微生物组数据下游分析的R包。该包的具体贡献在于提供一种BALF导向的分析记录，将处理后的微生物和宿主来源特征表、样本元数据、阴性对照标志、训练和测试分区、来源特异性模型比较、校准和重采样摘要以及可生成图形的结果表保持在一个工作流程内连接。该包接受跨分类或特征水平的微生物特征表，包括属水平和mOTU水平，并利用GSE252118 BALF mNGS资源以及外部PRJNA714488 BALF鸟枪法宏基因组数据集进行了评估。
**主要技术方法**
LungMicroHostR作为R包实现，位于读段水平质量控制和分类谱分析之后，操作于宏基因组、宏转录组和宿主转录组流程生成的处理后特征表。包设计包含四个组件：数据输入、预处理、分析模块和结果报告。输入组件接受属、种或mOTU水平的微生物特征表、宿主转录本计数矩阵、免疫细胞比例估计、CNV衍生摘要、样本注释、疾病标签、训练和测试分区及阴性对照表。预处理组件协调元数据、构建分析对象并记录特征过滤决策。分析模块总结微生物特征、比较特征来源特异性模型、估计基于重采样的不确定性并生成可重复使用的结果表。应用于GSE252118公开数据集，该数据集包含402例肺癌或肺部感染患者BALF样本（123例肺癌，279例肺部感染），预定义分区为284训练样本和118测试样本。特征排名、缩放、模型拟合和阈值定义均在训练集中进行，测试集用于最终性能评估和重采样不确定性估计。阴性对照基于流行率的特征筛选：对每个属水平特征，计算训练样本中的流行率和平均相对丰度，以及阴性对照中的流行率。保留标准为训练集流行率≥0.05且平均相对丰度≥1×10??。阴性对照流行率>0.10的特征被记录为复发性阴性对照特征并排除。模型评估采用逻辑回归、最近质心分类器和主成分逻辑回归，通过Youden指数确定阈值，使用AUC、平均精度、准确率、平衡准确率、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、F1分数和Brier分数汇总性能。不确定性通过自举重采样（1000次）估计95%置信区间，并进行置换检验和配对自举比较。外部数据集PRJNA714488包含26个BALF样本（10个对照，16个非小细胞肺癌），使用mOTUs v4进行谱分析，生成mOTU水平特征表。
**研究结果**
**模块化BALF mNGS分析工作流程**：LungMicroHostR成功将输入表组装为公共数据对象，生成样本匹配摘要、特征过滤表、阴性对照流行率估计、模型拟合特征表和模型性能表。
**公开BALF mNGS数据集**：402个样本中，DNA微生物谱、RNA微生物谱、宿主转录组数据、免疫细胞估计和CNV衍生摘要均可用。预定义分区为284训练样本和118测试样本。
**基于阴性对照的特征筛选**：过滤前DNA微生物谱含1,500个属水平特征，RNA微生物谱含1,630个。根据训练集流行率和丰度标准，保留109个DNA属特征和301个RNA属特征。记录29个DNA属和31个RNA属在阴性对照中高流行率，排除后剩余88个DNA属和272个RNA属特征。
**宿主转录组和微生物谱模型**：在测试集中，宿主转录组模型表现最强。10特征最近质心模型获得最高AUC 0.772（95%CI 0.680–0.860），平衡准确率0.671，灵敏度0.500，特异度0.841，Brier分数0.173。20特征模型AUC 0.761，平衡准确率最高（0.731）。RNA微生物5特征逻辑回归模型AUC 0.745（95%CI 0.655–0.832），特异度高（0.902）但灵敏度较低（0.472）。DNA微生物和CNV模型性能较低。
**整合模型**：结合10个宿主转录组特征和5个RNA微生物属特征的逻辑回归模型获得测试集AUC 0.765（95%CI 0.655–0.866），平衡准确率0.720，灵敏度0.611，特异度0.829，Brier分数最低（0.168）。配对自举比较显示该组合模型与最强宿主转录组模型之间的AUC差异为?0.007（95%CI跨越零），与宿主转录组逻辑回归模型差异为0.012（95%CI跨越零），表明差异不显著。
**预测概率、校准曲线和系数谱**：整合模型的预测概率在肺癌样本中总体高于肺部感染样本，但两组分布部分重叠。校准曲线显示在上层概率区间观测肺癌比例递增，从平均预测概率0.182时的0.250升至0.316时的0.304和0.576时的0.708。系数谱中正系数最大的包括RNA微生物属Comamonas、宿主转录组特征AREG和TIMP3、RNA微生物属Methylophilus及宿主转录组特征SLC66A2；负系数最大的为OR52B6、TAS2R4、RNA微生物属Alicycliphilus、WIPI1和Delftia。
**外部BALF mOTU水平特征表评估**：PRJNA714488数据集经mOTUs v4谱分析产生388个mOTU特征，LungMicroHostR匹配表型元数据生成388特征×26样本丰度矩阵，并输出样本水平微生物分配摘要、特征流行率表、多样性摘要、Bray-Curtis主坐标分析和探索性重复分层交叉验证输出。
**讨论与结论**
LungMicroHostR专为呼吸道mNGS数据中微生物谱、宿主来源分子测量和阴性对照信息的协调下游分析而设计。其优势在于BALF特异性数据结构，协调处理微生物和宿主来源特征表、样本分区、阴性对照筛选标志、来源特异性模型比较、校准和重采样输出及可生成图形的结果表。阴性对照流行率对BALF等低生物量样本尤为重要，该包将阴性对照流行率存储为透明筛选标志，区别于正式的污染物概率建模。公开数据分析表明宿主转录组特征是区分肺癌与肺部感染的最强参考信号，RNA微生物特征保留可测量的判别信息，联合模型在多个测试集指标上实现平衡性能。模型开发与测试集评估分离是核心原则，特征过滤、模型拟合和阈值定义仅限训练数据。局限性包括外部数据集样本量小（26例），未来需更大规模多中心数据集进一步基准测试。结论：LungMicroHostR为BALF mNGS宿主-微生物组数据下游分析提供了连接微生物谱、宿主来源分子测量、阴性对照信息、模型评估和可视化的R框架，提供了文档化的宿主-微生物组数据整合、基于阴性对照的微生物特征筛选和比较模型评估工作流程。该研究发表于《Frontiers in Bioinformatics》。
