《Journal of Inflammation Research》：UHPLC -Q-Orbitrap HRMS Integrated with Network Pharmacology Reveals the Anti-COPD Mechanism of Jianzhong Peiyuan Decoction and Functional Validation of Core Component Luteolin
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摘要
目的：建中培元汤基于参苓白术散化裁，常用于贵州地区稳定期慢性阻塞性肺疾病（COPD）的治疗，但其化学成分与药效学机制尚不明确。本研究旨在探讨该方治疗COPD的药效物质基础及多靶点通路，并通过体外细胞实验验证其关键活性成分木犀草素（Luteolin）的
摘要
目的：建中培元汤基于参苓白术散化裁，常用于贵州地区稳定期慢性阻塞性肺疾病（COPD）的治疗，但其化学成分与药效学机制尚不明确。本研究旨在探讨该方治疗COPD的药效物质基础及多靶点通路，并通过体外细胞实验验证其关键活性成分木犀草素（Luteolin）的干预效应。方法：采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS鉴定建中培元汤的化学成分；通过网络药理学筛选核心成分、获取药物-疾病靶点，并进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络、基因本体（GO）功能及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析；运用分子对接和分子动力学模拟评估核心成分与关键靶点的结合稳定性；利用香烟烟雾提取物（CSE）诱导的16HBE细胞损伤模型，通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测SRC/MAPK1/Akt/STAT3及PPARγ/CD36/ABCA1通路中关键靶点的表达。结果：研究鉴定出建中培元汤中497种化学成分，包括Longikaurin A、山柰酚（kaempferol）和木犀草素等9种关键活性成分；发现675个COPD治疗潜在靶点，其中通过PPI网络分析突出6个核心靶点——SRC、ESR1、AKT1、MAPK1、STAT3和EGFR；KEGG通路富集提示脂质与动脉粥样硬化通路至关重要；分子对接和分子动力学模拟显示活性成分（尤其是木犀草素）与核心靶点结合稳定；在CSE诱导的COPD模型16HBE细胞体外实验中，SRC、AKT1、MAPK1、STAT3、EGFR和CD36的mRNA过表达，而ESR1、PPARγ和ABCA1的mRNA降低；木犀草素呈剂量依赖性恢复上述基因的正常表达。结论：建中培元汤通过多成分、多靶点、多通路发挥COPD治疗作用；木犀草素作为关键成分，通过调控炎症和脂质代谢途径减轻香烟烟雾诱导的支气管损伤。本研究阐明了该方治疗稳定期COPD的物质基础和分子机制，为其临床应用和质量标准提供了实验和理论支持。
关键词：建中培元汤；慢性阻塞性肺疾病；UHPLC-Q-Orbitrap HRMS；网络药理学；分子对接；木犀草素
**建中培元汤抗COPD机制研究：基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS、网络药理学与体外验证的整合分析**
**研究背景与目的**
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是以慢性支气管炎和肺气肿为特征、导致气道重塑、氧化应激和持续性炎症的疾病，临床表现为咳嗽、咳痰和呼吸困难。据世界卫生组织2024年最新数据，COPD已成为全球第四大死因，2021年导致约350万人死亡，占全球死亡人数的5%。吸烟和空气污染是主要危险因素，但仅15%-20%的吸烟者发展为COPD，且戒烟不能完全阻止疾病进展，提示易感个体存在持续慢性炎症反应。目前临床治疗主要依赖长效抗胆碱能药物、长效β2受体激动剂和吸入性糖皮质激素，这些干预多以缓解症状为主，未能针对慢性炎症、氧化应激、气道重塑和肺功能进行性下降等病理生理机制，且长期使用存在累积不良反应和器官毒性。因此，亟需开发安全有效且患者易接受的治疗策略。
建中培元汤源于经典方参苓白术散，由党参、黄芪、白术、茯苓、薏苡仁、山药、扁豆、五味子、补骨脂、当归、丹参、甘草等12味中药组成，在贵州地区广泛用于稳定期COPD（肺脾肾气虚证）的治疗。中医理论认为，COPD虽表现为咳嗽、喘息等肺系症状，但病机涉及肺、脾、肾三脏功能失调及全身气机紊乱，宗气生化不足导致水液代谢异常而生痰，痰阻肺络和气道最终引发咳、痰、喘等表现。该方通过补益肺脾肾之气、调理全身气机以治生痰之本。已有临床观察显示其能改善症状、提高肺功能和生活质量，但其化学组成和药效学机制尚不清楚。本研究整合UHPLC-Q-Orbitrap HRMS化学分析、网络药理学预测、分子对接与分子动力学模拟以及体外细胞实验，系统阐明建中培元汤治疗COPD的药效物质基础和多靶点作用机制，为核心成分木犀草素的功能验证及制剂质量控制提供依据。
**主要技术方法**
研究人员首先采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS（超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱）对建中培元汤颗粒进行化学成分鉴定，利用正负离子模式采集数据并匹配数据库。然后基于TCMSP数据库筛选活性成分（口服生物利用度OB≥30%，类药性DL≥0.18），并通过Swiss Target Prediction预测靶点。从GeneCards、OMIM、DisGeNET、DrugBank数据库获取COPD疾病靶点，取交集获得675个潜在治疗靶点，利用STRING数据库构建PPI网络，经CytoNCA插件筛选核心靶点。同时进行GO功能和KEGG通路富集分析。分子对接使用AutoDock Vina计算结合自由能，分子动力学模拟采用CHARMM36力场进行100 ns模拟并计算MM-PBSA结合自由能。体外实验采用人支气管上皮细胞系16HBE（购自明舟生物），以香烟烟雾提取物（CSE）诱导细胞损伤模型，通过CCK-8法检测细胞活力，RT-qPCR检测关键基因mRNA表达。样本来源为贵州中医药大学第一附属医院购得的建中培元汤药材。
**研究结果**
**1. 化学成分分析**
UHPLC-Q-Orbitrap HRMS鉴定出建中培元汤中497种化合物，包括76种黄酮类、56种萜类、35种脂质、32种酚酸类及其衍生物、24种香豆素类、22种氨基酸类、15种碳水化合物类、10种有机酸类、9种鞣质、8种甾体类、7种木脂素类、6种生物碱类、4种吲哚类、3种维生素、2种二苯乙烯类、3种醌类、1种核苷酸类及184种其他类型。
**2. 活性成分与靶点筛选**
通过TCMSP数据库筛选出53种满足OB≥30%和DL≥0.18的活性成分，进一步按OB和DL值排序确定9种关键化合物：Longikaurin A、山柰酚（Kaempferide）、金圣草黄素（Chrysoeriol）、Vitrofolal A、香叶木素（Diosmetin）、木犀草素（Luteolin）、香豆雌酚（Coumesterol）、山柰酚（Kaempferol）和羟基芫花素（Hydroxygenkwanin）。
**3. 靶点预测与PPI网络分析**
从四个疾病数据库去重后获得9,300个COPD相关靶基因，与建中培元汤活性成分对应的816个靶基因取交集，得到675个潜在治疗靶点。PPI网络包含673个节点和2,204条边，经CytoNCA拓扑分析（基于介数、紧密度、度、特征向量、局部平均连通性和网络指标）筛选出6个核心靶点：SRC、ESR1、AKT1、MAPK1、STAT3和EGFR。
**4. GO与KEGG富集分析**
GO富集分析显示显著富集的生物学过程为肽基丝氨酸磷酸化（GO:0018105，含88个靶点），细胞组分涉及膜筏（GO:0045121）、膜微区（GO:0098857）和突触前膜整合组分（GO:0099056），分子功能主要包括蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性（GO:0004674）、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性（GO:0004714）和蛋白酪氨酸激酶活性（GO:0004713）。KEGG通路富集分析显示主要涉及脂质与动脉粥样硬化通路（hsa05417）、钙信号通路（hsa04020）和糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（hsa04933）。
**5. 分子对接与分子动力学模拟**
分子对接结果显示9种化合物与6个核心靶点（SRC、ESR1、AKT1、MAPK1、STAT3、EGFR）的结合能均低于?5.0 kcal/mol，其中Luteolin-SRC（?9.07 kcal/mol）、Coumesterol-SRC（?9.06 kcal/mol）、Chrysoeriol-ESR1（?8.19 kcal/mol）、Luteolin-AKT1（?8.61 kcal/mol）、Kaempferide-MAPK1（?8.44 kcal/mol）、Chrysoeriol-STAT3（?8.46 kcal/mol）和Kaempferide-EGFR（?8.16 kcal/mol）显示出强结合亲和力。100 ns分子动力学模拟中，所有复合物的RMSD值趋于稳定，RMSF显示残基波动低，Rg保持紧凑，SASA稳定，且持续形成氢键作用。MM-PBSA计算得到结合自由能：Luteolin-SRC（?5.9 kcal/mol）、Luteolin-ESR1（?8.5 kcal/mol）、Luteolin-AKT1（?3.4 kcal/mol）、Luteolin-MAPK1（?8.1 kcal/mol）、Luteolin-STAT3（?13.7 kcal/mol）和Luteolin-EGFR（?9.9 kcal/mol），其中Luteolin-STAT3结合最强，Luteolin-AKT1相对较弱。
**6. 细胞实验验证**
CCK-8结果显示，5-40 μg/mL的木犀草素对16HBE细胞无明显细胞毒性（存活率>85%），而80 μg/mL时细胞活力显著下降。RT-qPCR检测显示，与对照组相比，CSE模型组中SRC、AKT1、MAPK1、STAT3、EGFR和CD36的mRNA表达显著上调（p<0.01），而ESR1、PPARγ和ABCA1的mRNA表达显著下调（p<0.05，p<0.01）。与CSE组相比，不同浓度木犀草素（10、20、40 μmol/L）呈剂量依赖性地逆转上述异常表达：显著降低SRC、AKT1、MAPK1、STAT3、EGFR和CD36的mRNA水平，同时升高ESR1、PPARγ和ABCA1的mRNA水平。
**讨论与结论**
讨论部分指出，COPD发病机制涉及香烟烟雾激活SRC激酶导致MMP-9/MMP-12、组织蛋白酶K及IL-17、TNF-α等促炎介质上调，EGFR/MAPK通路过度激活促进气道平滑肌异常增殖，AKT1持续激活NF-κB引发炎症级联。脂质代谢紊乱通过LOX-1/NF-κB/AKT通路加剧上皮凋亡和黏液过度分泌，CD36上调促进泡沫细胞形成，PPARγ下调失去抗炎保护，ABCA1下调导致胆固醇外流障碍和NLRP3炎症小体活化。木犀草素作为核心成分，通过同时干预炎症级联和脂质代谢平衡，逆转CSE诱导的转录异常。研究结论：本研究采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS鉴定出建中培元汤中497种化学成分，筛选出53种活性成分和9种核心化合物，确定675个治疗靶点，PPI分析突出6个枢纽蛋白，分子对接和100 ns分子动力学模拟证实木犀草素与6种蛋白的稳定结合。体外实验表明5-40 μg/mL木犀草素可剂量依赖性地逆转CSE诱导的炎症和脂质代谢相关基因异常表达，无显著细胞毒性，提示其对支气管上皮细胞的保护作用。虽然目前仅为计算预测和mRNA水平证据，但为后续深入研究奠定了基础。未来将建立香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型进行体内药效评估，进行定量成分分析确定剂量-效应关系，并探究活性成分间的协同作用。该研究为建中培元汤治疗稳定期COPD提供了实验和理论支持，有助于其临床应用和质量标准制定。
