利用整合生物信息学与机器学习探索儿童哮喘中应激颗粒相关的潜在生物标志物

《Journal of Inflammation Research》：Exploring Potential Stress Granule-Related Biomarkers in Childhood Asthma Using Integrated Bioinformatics and Machine Learning

　　

摘要
目的：哮喘是儿童常见的慢性肺部疾病，但应激颗粒（SGs）在其发病机制中的作用尚不清楚。本研究旨在通过整合生物信息学和机器学习方法，探讨儿童哮喘（CA）与应激颗粒（SGs）之间的重叠基因及调控机制。
方法：应用机器学习算法在候选基因中筛选潜在生物标志物。验证其表达水平，随后进行受试者工作特征（ROC）分析。开展多种生物信息学分析，包括mRNA-miRNA和转录因子调控网络，以探索其潜在功能。最后，采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）验证CA与健康对照血液样本之间的表达差异。
结果：通过机器学习初筛出11个候选基因，确定3个潜在生物标志物（HNRNPA2B1、RPE、TAF15）。这些生物标志物表现出较强的诊断性能（AUC > 0.7）。GeneMANIA和基因集富集分析（GSEA）显示其功能富集于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）再生等生物学过程。免疫浸润分析鉴定出四种差异浸润免疫细胞类型：CD56^dim自然杀伤细胞、中央记忆CD8⁺T细胞、未成熟B细胞和单核细胞。此外，RT-qPCR验证证实，与健康对照相比，CA患者中HNRNPA2B1、RPE和TAF15的mRNA表达水平显著升高，与生物信息学预测一致。
结论：本研究筛选出CA中三个与SGs相关的潜在生物标志物，为疾病发病机制提供了新见解，并为改善治疗提供了潜在的分子靶点。

论文解读

**研究背景与问题**

哮喘是儿童最常见的慢性呼吸系统疾病之一，以异质性、可逆性气道炎症、高反应性和重塑为特征，临床表现为反复发作的喘息、气短、胸闷和咳嗽。全球约14%的儿童受到哮喘影响，反复发作严重损害患儿生活质量，并给家庭和医疗系统带来沉重社会经济负担。儿童哮喘（childhood asthma, CA）的发生源于遗传易感性与环境触发因素（如过敏原、呼吸道感染和空气污染）之间的复杂相互作用。目前吸入性糖皮质激素是哮喘的核心治疗手段，但长期使用尤其是高剂量可能带来生长速度受影响等不良反应。临床常用的生物标志物如呼出气一氧化氮（FeNO）、血嗜酸性粒细胞计数和血清总IgE在CA中敏感性和特异性有限，难以准确反映气道炎症的异质性，无法有效预测急性发作或指导个体化治疗。因此，识别新的分子生物标志物对于CA的精准诊疗具有重要意义。

近年来，细胞应激反应机制在炎症性疾病中的作用日益受到关注。应激颗粒（stress granules, SGs）是真核细胞在氧化应激、病毒感染和热休克等多种应激条件下形成的动态无膜细胞质凝聚体，其形成主要由液-液相分离（liquid-liquid phase separation, LLPS）驱动，涉及未翻译mRNA、RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs）、翻译起始因子等成分的协同聚集。SGs作为mRNA分类和应激信号的中枢，在转录后水平调控基因表达以促进细胞适应。SG组装与解聚的动态平衡与多种疾病发病机制密切相关，包括神经退行性疾病、癌症和炎症性疾病。SGs可能通过隔离或释放特定炎症相关mRNA和信号蛋白，影响气道上皮细胞对氧化应激和病毒感染的响应，并可通过转录后调控机制调节免疫相关mRNA的稳定性，影响Th2型细胞因子的翻译效率和免疫细胞功能。然而，SGs与CA之间的具体联系，特别是SG相关分子的身份和功能，仍基本未被探索。近年来，机器学习方法已广泛应用于哮喘预测模型构建和生物标志物筛选，但尚无研究将机器学习方法应用于SGs相关基因与CA的整合分析。

**研究内容与结论**

该研究发表于《Journal of Inflammation Research》，旨在通过整合生物信息学和机器学习方法，系统探究CA与SGs之间的重叠基因和调控机制，筛选SG相关潜在生物标志物。研究人员从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）获取训练集GSE27011（含17例CA样本和18例健康对照）、验证集GSE40732（含97例CA样本和97例健康对照）以及SG相关基因数据集GSE99304（含三份SGcoreRNA和三份TotalRNA样本）。通过差异表达分析、维恩图交叉、功能富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建、三种机器学习算法（随机森林、LASSO、Boruta）筛选、独立数据集验证、ROC曲线分析、列线图构建、转录因子和miRNA调控网络分析、GeneMANIA分析、单基因GSEA、免疫浸润分析、候选药物预测以及RT-qPCR实验验证，最终确定HNRNPA2B1、RPE和TAF15为CA中SG相关的三个潜在生物标志物。这些标志物在训练集和验证集中表达趋势一致且显著升高，AUC值均大于0.7，显示出良好的诊断区分能力。RT-qPCR实验进一步证实CA患者血液中这三个基因的mRNA表达水平显著高于健康对照。该研究为CA的发病机制提供了新见解，并为改善治疗提供了潜在的分子靶点。

**主要关键技术方法**

研究人员首先利用limma和DEseq2包分别对GSE27011和GSE99304数据集进行差异表达分析，获得CA相关差异表达基因（DEGs）和SG相关DEGs，并通过VennDiagram取交集获得候选基因。随后运用clusterProfiler包进行GO和KEGG富集分析，利用STRING数据库和Cytoscape软件构建PPI网络，采用cytohubba的MCC算法筛选前50个关键基因。在此基础上，分别使用randomForest包（随机森林）、glmnet包（LASSO）和Boruta包进行特征基因筛选，取三者交集确定候选生物标志物。在独立验证集GSE40732中验证表达差异，采用pROC包进行ROC曲线分析，rms包构建列线图并进行校准曲线和决策曲线分析。通过NetworkAnalyst 3.0平台的JASPAR和TarBase数据库构建TF-基因和基因-miRNA调控网络，利用GeneMANIA数据库和GeneCard数据库进行功能分析和亚细胞定位预测，基于psych包进行单基因GSEA，通过ssGSEA方法评估免疫细胞浸润。最后，收集上海儿童医院2025年10月的6例CA急性发作患者和6例健康体检者（各含3男3女，年龄5-14岁）血液样本，采用RT-qPCR验证三个生物标志物的表达差异。

**研究结果**

**DEGs筛选：** 对GSE27011数据集进行差异分析，获得422个显著差异表达基因（215个上调，207个下调），火山图和热图清晰显示CA组与对照组可良好区分。对SGcoreRNA与TotalRNA样本进行差异分析，获得10589个SG相关DEGs（5403个上调，5186个下调）。

**候选基因获取与富集分析：** 通过维恩图取交集获得196个重叠候选基因。GO分析获得230条信号通路（168条BP、30条CC、32条MF），KEGG分析获得15条通路。最显著的BP通路包括磷酸戊糖支路、NADPH再生和类异戊二烯分解代谢过程；MF方面为苦味受体活性、通用转录起始因子活性和味觉受体活性；CC方面为含磷基团转移酶复合物、RNA聚合酶II转录抑制复合物和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物。KEGG最显著通路为磷酸戊糖途径、基础转录因子和氨基酸生物合成。

**核心疾病相关基因筛选：** 将196个候选基因输入STRING数据库构建PPI网络（136个节点、196条边），通过MCC算法筛选前50个关键候选基因。随机森林分析（重要性评分>0.2）获得31个特征基因（Gene Set 1），LASSO回归（lambda.1se）获得16个特征基因（Gene Set 2），Boruta分析确认22个特征基因（Gene Set 3）。三者取交集获得11个候选生物标志物：CCNH、CD247、HNRNPA2B1、KRT5、NOTCH2、RPE、TAF15、TAS2R50、DOX20、MKI67、PAICS。

**HNRNPA2B1、RPE和TAF15确认为潜在生物标志物：** 在训练集中，11个候选基因中8个显著上调（CCNH、CD247、HNRNPA2B1、KRT5、NOTCH2、RPE、TAF15、TAS2R50），3个显著下调（DOX20、MKI67、PAICS）。在验证集中，仅HNRNPA2B1、RPE和TAF15仍保持显著升高且趋势与训练集完全一致。ROC分析显示三者的AUC值分别为0.745、0.781和0.886，均大于0.7，表明具有良好的区分CA与正常样本的能力。

**列线图构建与评估：** 基于三个潜在生物标志物构建列线图模型，总分191分时CA发病概率达0.961。校准曲线显示表观线和偏差校正线均接近理想线（p=0.906），说明模型校准度良好。列线图ROC曲线的AUC值达0.941，表明模型预测性能优异。决策曲线分析显示三个生物标志物对疾病干预均有显著意义。

**转录因子和调控网络分析：** TF-基因调控网络显示TFAP2A和E2F1共同调控HNRNPA2B1和RPE，FOXC1同时调控HNRNPA2B1和TAF15，表明关键转录因子可能通过协同作用影响潜在生物标志物的表达模式。基因-miRNA调控网络基于Degree算法筛选出前50个基因-miRNA调控对，为理解转录后调控机制提供线索。

**功能分析和免疫学关联：** GeneMANIA分析显示三个生物标志物与功能相似基因存在物理相互作用、共表达和预测相互作用，涉及NADPH再生和葡萄糖-6-磷酸代谢过程等生物学功能。亚细胞定位预测显示HNRNPA2B1主要定位于细胞外空间和细胞核，RPE富集于细胞外空间和细胞质，TAF15主要位于细胞核。单基因GSEA分析中，HNRNPA2B1显著富集于629条通路（前5包括含帽内含子pre-mRNA加工、mRNA剪接、剪接体、mRNA加工和有丝分裂前中期），RPE富集于811条通路（前5包括含帽内含子pre-mRNA加工、角化、神经活性配体-受体相互作用、神经元系统和GPCR配体结合），TAF15富集于746条通路（前5与HNRNPA2B1重叠于含帽内含子pre-mRNA加工、mRNA剪接、剪接体和mRNA加工）。免疫浸润分析鉴定出四种差异免疫细胞：CD56^dim自然杀伤细胞、中央记忆CD8⁺T细胞、未成熟B细胞和单核细胞。相关性热图显示中央记忆CD8⁺T细胞与未成熟B细胞呈极显著正相关（p<0.001），CD56^bright自然杀伤细胞与单核细胞显著相关（p<0.05）。潜在生物标志物与差异免疫细胞的相关性分析显示，中央记忆CD8⁺T细胞与HNRNPA2B1和TAF15呈负相关。

**候选药物评估：** 药物-化合物靶向预测显示，氯化钴和丙戊酸可共同靶向HNRNPA2B1和RPE；长春新碱、苯并(a)芘、环孢素和甲基氯化汞可作用于HNRNPA2B1和TAF15；槲皮素和对乙酰氨基酚可同时靶向三个潜在生物标志物。按p值排序的前三个药物-基因对包括：萘哌地尔与RPE（p=0.003296，Combined Score=2718.11）、拉沙洛西与TAF15（p=0.003296，Combined Score=2718.11）、槲皮素与RPE（p=0.003596，Combined Score=2443.77）。

**RT-qPCR验证：** 基于上海儿童医院收集的6例CA急性发作患者和6例健康对照血液样本，RT-qPCR结果显示HNRNPA2B1、RPE和TAF15在CA血液样本中的表达显著高于对照组（p<0.001），与生物信息学预测一致。

**讨论与结论总结**

讨论部分指出，HNRNPA2B1作为SG核心成分参与RNA加工和代谢，可能通过调控GATA3和IL-4/5/13等免疫调节因子的RNA剪接和稳定性促进气道持续炎症，且在氧化应激或病毒感染时从细胞核转位至细胞质促进SG组装，可能增强Th2细胞因子的mRNA稳定性和剪接效率。RPE是磷酸戊糖途径中的代谢酶，主要功能是提供NADPH以保护细胞免受氧化应激损伤，该研究首次报道RPE在CA血液中上调，可能代表对哮喘相关氧化应激或感染的代偿性反应。TAF15位于17q21.31染色体区域，该区域是CA的重要易感位点，包含ORMDL3和GSDMB等已确认的哮喘相关基因，TAF15可能与该区域已知风险变异存在连锁不平衡，且其参与RNA剪接和代谢，可能通过调节免疫相关基因的选择性剪接参与哮喘气道炎症。GSEA结果显示三个生物标志物均富集于RNA代谢通路，表明它们可能通过调节RNA代谢参与哮喘过程。免疫浸润分析发现的CD56^dim NK细胞变化可能反映宿主对反复气道损伤的免疫应答，而中央记忆CD8⁺T细胞与HNRNPA2B1和TAF15的负相关提示这些RNA结合蛋白可能通过调节关键转录因子或趋化因子受体的选择性剪接影响CD8⁺T细胞向中央记忆表型的分化。药物预测中槲皮素可能同时靶向三个生物标志物，提示其可能通过调节RNA结合蛋白表达影响SG装配动力学。

研究结论：通过整合生物信息学和机器学习方法，本研究初步确定了CA中三个SG相关的潜在生物标志物：HNRNPA2B1、RPE和TAF15。这些候选基因在训练集和验证集中表现出相对一致的表达趋势，并显示出中等诊断区分能力（AUC>0.7）。RT-qPCR进一步证实CA患者血液中其表达水平显著高于健康对照。然而，鉴于本研究主要基于转录组数据和生物信息学分析，且RT-qPCR验证样本量有限，无法得出关于因果关系或临床应用的确定性结论。因此，上述发现应被视为假设生成性的，所识别的基因应视为潜在的SG相关标志物而非经过验证的临床生物标志物。