多转子咪唑类荧光团用于小鼠手术标本中鳞状细胞癌浸润边缘的快速描绘

《Frontiers in Chemistry》：Multi-rotor imidazole-based fluorophores for rapid delineation of squamous cell carcinoma infiltration margins in murine surgical specimens

　　

摘要翻译：多转子咪唑衍生物因其独特的电子和光物理性质以及多样的应用而受到越来越多的关注。结合聚集诱导发光（AIE）机制，多转子咪唑核心也可功能化为AIE发光体（AIEgens）。在此，研究人员报道了一类新型AIEgens，命名为TPIT-X，其具有供体-π-受体（D-π-A）骨架，其中1,4,5-三苯基咪唑作为供体，噻吩作为π-连接体。通过引入合适的受体单元，研究人员设计并合成了TPIT-1至TPIT-6，其发射颜色可从绿色（490 nm）调谐至深红色（695 nm），几乎覆盖整个可见光谱。这些分子还表现出典型的AIE特性，荧光增强高达30倍。利用其AIE特性，与抗EGFR抗体偶联的TPIT-6纳米颗粒成功实现了离体小鼠手术标本中鳞状细胞癌（SCC）肿瘤浸润边缘的快速测定，从而将其定位为手部SCC切除术中快速术中肿瘤活检的有前景的成像剂。

论文解读文章

**研究背景与意义**

手部肿瘤的精准切除在临床实践中具有极其重要的意义，因为手部在日常活动中承担着关键功能。即使是微小的手部病灶也可能导致持续性疼痛、明显畸形或功能障碍，显著降低患者的生活质量。在手部肿瘤中，最常见的恶性肿瘤是鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma, SCC），占所有病例的58%–90%。由于手术切除仍是手部SCC治疗的主要手段，术中实时识别SCC肿瘤边缘至关重要。过度激进的手术切除可能损害手部的外观和基本功能，而过于保守的切除则存在残留肿瘤组织的风险，这些残留细胞可能侵犯邻近结构，尤其是区域淋巴结。已发表数据显示，约14.3%的SCC患者在5年内发生远处转移，这与预后恶化相关。目前术中切缘评估主要依赖对选定组织标本的冷冻切片分析，该技术涉及耗时多步骤过程（标本采集、运输、冷冻、切片、染色和病理判读），仅能提供有限数量的标本信息，且准确性高度依赖病理学家的经验以区分细胞形态。此外，冷冻过程中冰晶的形成可能损害细胞完整性，从而影响准确的细胞识别。因此，全球研究人员一直在探索各种替代技术用于肿瘤边缘的实时评估。

荧光方法因其高灵敏度和易检测性而被证明是此类应用的优秀候选方案。然而，传统有机荧光团大多遭受聚集诱导猝灭（aggregation-caused quenching, ACQ）效应，表现为聚集态发射减弱甚至完全猝灭，严重限制了其应用。2001年首次提出的聚集诱导发光（aggregation-induced emission, AIE）概念彻底改革了荧光团开发的传统规则。与ACQ荧光团相反，聚集诱导发光体（AIEgens）在分散态下发射微弱或无发射，但在分子聚集时显著发光。这一独特特性使AIEgens成为生物传感和生物成像的革命性材料。尽管目前已报道了多种AIEgens，但开发发射波长可精细调谐以满足多样化应用需求的系统仍具有重要意义。本研究基于1,4,5-三苯基咪唑核心结构，构思并开发了一种新型发射可调谐的AIE平台。

**研究内容与结论**

研究人员开发了一类新型AIEgens，命名为TPIT-X，其具有供体-π-受体（D-π-A）骨架，其中1,4,5-三苯基咪唑作为供体，噻吩作为π-连接体。通过系统引入不同电子亲和力和空间位阻的受体单元，设计并合成了TPIT-1至TPIT-6。这些分子表现出从绿色（490 nm）到深红色（695 nm）的可调谐发射窗口，几乎覆盖整个可见光谱。光学评估证实了它们典型的AIE特性，荧光增强高达30倍。为实现生物医学应用，研究人员将发射深红光的TPIT-6封装于DSPE-PEG₂₀₀₀脂质中制备纳米颗粒（NPs），并进一步与抗表皮生长因子受体（anti-EGFR）抗体偶联，形成TPIT-6 NPs-Ab探针。该探针在细胞实验中表现出对SCC7细胞的特异性靶向能力。随后，研究人员设计了一种基于该探针的术中病理诊断方法，并在C3H小鼠SCC皮下肿瘤切除模型中进行了评估。离体组织荧光成像结果显示，新鲜切除的边缘组织经TPIT-6 NPs-Ab孵育后，肿瘤区域呈现出清晰的高荧光信号，且荧光区域与组织学染色验证的实际肿瘤位置相对应。

**关键技术方法**

本研究采用的关键技术方法包括：1）分子设计与合成：通过McMurry偶联反应和Knoevenagel缩合反应等简便路线合成系列TPIT-X化合物；2）光学表征：利用紫外-可见吸收光谱和光致发光（PL）光谱评估化合物的光物理性质；3）纳米颗粒制备：采用DSPE-PEG₂₀₀₀两亲性聚合物通过超声法包封TPIT-6制备纳米颗粒，并通过抗体偶联实现主动靶向功能；4）细胞实验：使用SCC7小鼠鳞状细胞癌细胞系（购自ATCC）和正常小鼠平滑肌细胞（SMCs），通过MTT法评估细胞毒性，利用共聚焦激光扫描显微镜验证靶向能力；5）离体组织成像：在C3H小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）上建立SCC7皮下肿瘤模型，手术切除后对边缘组织进行探针孵育，采用IVIS LumiNova II成像系统进行荧光成像，并通过苏木精-伊红（H&E）染色验证肿瘤边界。

**研究结果**

**设计与合成**：基于1,4,5-三苯基咪唑核心结构，研究人员构建了D-π-A型AIE分子平台TPIT-X。通过引入不同受体单元（苯基、氰基、吡啶基、吡啶鎓盐等），成功合成了TPIT-1至TPIT-6。其中TPIT-1通过McMurry偶联反应制备，TPIT-2至TPIT-6通过醛与相应活性亚甲基化合物的缩合反应获得，TPIT-5和TPIT-6的碘离子进一步通过离子交换转换为六氟磷酸根离子（PF₆^?）。所有结构均经¹H NMR和HRMS确认。

**光学性质**：紫外-可见吸收和PL光谱显示，TPIT-1至TPIT-6的吸收峰从388 nm逐渐红移至507 nm，发射峰覆盖490 nm（绿色）至695 nm（深红色）。这种红移归因于受体单元吸电子能力逐渐增强（苯基<氰基<吡啶基），有效强化了分子内电荷转移（ICT）效应。在THF/水混合溶剂中，TPIT-4在低水含量时几乎无荧光，当水含量超过90%时表现出30.3倍的荧光增强，证实了典型的AIE特性。TPIT-5和TPIT-6在低水含量下的荧光猝灭归因于扭曲分子内电荷转移（TICT）态的形成，而高水含量下分子聚集抑制了TICT途径，触发AIE响应。

**细胞成像**：深红光发射的TPIT-6被选择用于生物成像。通过DSPE-PEG₂₀₀₀包封制备的TPIT-6 NPs具有均匀的球形形貌，平均直径约200 nm，发射峰位于697 nm。偶联anti-EGFR抗体后，TPIT-6 NPs-Ab的zeta电位由?29 mV变为?39 mV，表明抗体修饰在一定程度上提高了纳米颗粒的稳定性。MTT实验表明，TPIT-6 NPs和TPIT-6 NPs-Ab在100 μM浓度下与正常平滑肌细胞共孵育24小时后，细胞存活率均保持在90%以上，显示出低细胞毒性。共聚焦显微镜显示，TPIT-6 NPs-Ab能特异性结合SCC7细胞，而TPIT-6 NPs在相同条件下结合极少，证明抗体介导的主动靶向效果显著。

**离体组织成像**：在C3H小鼠SCC皮下肿瘤模型中，新鲜切除的疑似肿瘤边缘组织经TPIT-6 NPs-Ab（50 μM）室温孵育15分钟后，荧光成像显示肿瘤区域呈现高亮信号，且边缘清晰。对荧光区域边缘的组织进行H&E染色，镜下可见肿瘤细胞与正常组织共存，验证了荧光区域与实际肿瘤位置的一致性。该方法能快速判别手术切缘的肿瘤浸润状态，有望辅助外科医生进行快速病理诊断。

**结论与意义**

本研究报道了一种用于手部SCC肿瘤切除的有效离体活检方法。该方法的核心是一类基于多转子咪唑衍生物开发的新型AIEgens，具有合成简便和颜色可调性宽的优点。通过将不同受体单元引入D-π-A骨架，发射窗口可从绿色（490 nm）调谐至深红色（695 nm），几乎覆盖整个可见光谱。光学评估证实了其典型的AIE特性（荧光增强高达30倍）。TPIT-6被封装于DSPE-PEG₂₀₀₀脂质中制备纳米颗粒，并偶联抗EGFR抗体。细胞实验证实了TPIT-6 NPs-Ab的精确靶向能力后，研究人员设计了基于该探针的术中病理诊断方法，并在C3H小鼠SCC皮下肿瘤切除中进行了评估。荧光成像显示，该方法能有效实现组织标本中肿瘤边界的快速识别。该工作不仅为开发宽发射范围的AIE活性荧光团提供了创新策略，也拓宽了其在术中肿瘤活检中的潜在应用。研究发表在《Frontiers in Chemistry》。