在皮肤类器官中筛选交叉损伤反应鉴定出一个THBS2富集的促修复成纤维细胞状态在再生过程中

《Journal of Advanced Research》：Screening cross-injury responses in skin organoids identifies a THBS2-enriched pro-repair fibroblast state during regeneration

　　

皮肤损伤造成显著的全球健康负担。传统的伤口愈合模型无法区分进化上保守的再生机制与损伤特异性反应，因为它们无法捕捉微环境复杂性。本研究建立了一个高保真度的小鼠皮肤类器官平台，以模拟临床相关的应激源，并识别再生程序的核心调控组件。将成熟的皮肤类器官分别暴露于缺氧（hypoxia, HX）、高温（hyperthermia, HT）或高炎症（hyperinflammation, HI）。转录组分析识别出不同损伤类型中的分歧和收敛反应。利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）表征生理性和糖尿病伤口中的成纤维细胞状态。在所有应激源中鉴定出一个保守的85基因损伤响应模块，其中血小板反应蛋白2（thrombospondin 2, Thbs2）成为细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑网络中的一个高度连接的候选中心。与scRNA-seq数据集的整合进一步显示，Thbs2表达富集于一个独立定义的促修复成纤维细胞状态，该状态以ECM重塑和修复相关转录特征为特征。在糖尿病伤口微环境中，这种Thbs2相关的修复特征减弱，并伴随中间态成纤维细胞的积累。这些发现强调，特定功能细胞状态的获得与再生密切相关。该多应激平台通过将焦点从分子靶向转向恢复功能细胞状态，促进通用促愈合策略的开发。

**论文解读：皮肤类器官多应激平台揭示THBS2富集的促修复成纤维细胞状态在再生中的核心作用**

**研究背景与问题**
皮肤损伤是全球性的健康负担，其病因多样（如机械创伤、热烧伤、代谢功能障碍），但有效愈合依赖于三个核心过程：细胞外基质（ECM）重塑、功能性血管再生和上皮屏障恢复。尽管不同损伤类型存在共同需求，但传统伤口愈合模型（如二维细胞培养和整体动物模型）存在局限性：二维培养缺乏多细胞结构和空间组织，而整体动物模型受免疫波动、神经内分泌信号等系统变量干扰，难以区分进化保守的再生机制与损伤特异性反应。因此，迫切需要一种能够平行比较多种临床相关损伤条件的生理学相关平台，以识别再生程序的核心调控组件。

**研究目的与意义**
研究人员建立了高保真度的小鼠胚胎干细胞（mESC）来源的皮肤类器官平台，通过分别施加缺氧（HX）、高温（HT）和高炎症（HI）三种临床相关应激源，模拟损伤微环境，系统筛选交叉损伤反应。该平台避免了系统变量干扰，实现了高通量、可控的扰动。研究鉴定出一个保守的损伤响应模块，并发现其体现为一种动态的促修复成纤维细胞状态，其中血小板反应蛋白2（Thbs2/THBS2）是ECM重塑网络的关键节点。在糖尿病伤口微环境中，该促修复状态受损，伴随中间态成纤维细胞积累。该工作为多应激建模提供了可扩展的筛选平台，并强调了从分子靶向转向恢复功能细胞状态的治疗策略，对再生医学具有重要指导意义。论文发表在《Journal of Advanced Research》。

**主要关键技术方法**
研究人员利用mESC诱导的皮肤类器官（成熟期为30天），分别暴露于缺氧（1% O₂）、高温（40°C）或高炎症（10 ng/mL TNF-α）72小时，并在48小时进行批量RNA测序（bulk RNA-seq）以捕获适应性反应前的转录组。通过差异表达基因（DEG）分析和基因集富集分析（GSEA）识别共享和特异性通路。利用蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络（STRING数据库）和单基因GSEA鉴定Thbs2为候选中心。转录因子（TF）富集分析（iRegulon）识别JUNB和SRF为上游调控因子。为验证体内相关性，研究人员分析了公共scRNA-seq数据集：小鼠机械损伤伤口（CRA010641，含未损伤、第4天和第7天样本）和人类糖尿病伤口（HRA006211，含正常皮肤、正常伤口和糖尿病伤口样本）。通过独立于Thbs2的促修复模块评分（基于Acta2、Tagln等基因）将成纤维细胞分为静息态、中间态和促修复态，并进行伪时间轨迹分析（slingshot）和CellChat细胞间通讯推断。此外，利用高糖（42.5 mM葡萄糖）代谢应激模型和db/db糖尿病小鼠全层切除伤口模型验证Thbs2动态。

**研究结果**
1. **小鼠皮肤类器官高保真模拟天然组织结构**
通过分步诱导方案（BMP4、SB431542、FGF2、LDN193189等），mESC在30天内形成具有分层表皮、毛囊、皮脂腺样结构、皮脂腺细胞和神经元的类器官。免疫荧光显示CK5⁺基底角质形成细胞、PDGFR-α⁺真皮成纤维细胞、Loricrin⁺和CK10⁺分层表皮、SOX2⁺真皮乳头细胞以及TUJ1⁺/NEFH⁺神经元，证实多细胞区室整合。

2. **不同应激源诱导特异性转录程序**
在HX、HT和HI处理48小时后，PCA分析显示样本按应激条件分离。HX上调内质网蛋白稳态和胶原修饰酶（如Hsp47、P4ha1）；HT诱导神经肌肉重编程特征（Myh11、Acta2、钙信号基因）；HI激活自限性免疫轴（Cxcl10、Ccl5和Tnfaip3、Socs3）。GSEA确认HIF-1信号、热响应和TNF信号分别在各自组中富集。网络分析显示HX富集ECM组织和蛋白折叠，HT富集肌母细胞分化和离子转运，HI富集免疫信号。

3. **Thbs2被鉴定为保守损伤响应模块的候选中心**
跨三种应激源的GSEA比较发现，细胞周期和DNA复制通路均被抑制，而血管生成、ECM组织与重塑通路均被激活。DEG交集获得15个共享下调基因（如Dnmt3b、Epcam、Foxh1，富集于干细胞分化和增殖停滞）和85个共享上调基因（富集于ECM重组、细胞-基质粘附和伤口相关注释）。PPI网络分析显示Thbs2是高度连接节点，与Col6a1、Col18a1等ECM调节因子相连。单基因GSEA表明Thbs2表达与修复相关通路正相关。TF富集分析识别JUNB和SRF为潜在上游调控因子，共同靶向52个模块基因，其中24个共占，形成ECM（含Thbs2）、细胞骨架收缩（Ttn）和炎症信号（Junb）三个子模块。

4. **Thbs2富集于独立定义的促修复成纤维细胞状态，与ECM重塑和预测细胞通讯相关**
在小鼠伤口scRNA-seq数据中，Thbs2主要在成纤维细胞中表达，且在第4天和第7天显著升高。通过独立于Thbs2的促修复模块评分，成纤维细胞被分为静息态、中间态和促修复态。Thbs2表达显著富集于促修复态。伪时间分析提示从静息态经中间态到促修复态的转变，Thbs2表达在晚期升高。JUNB和SRF活性在第4天和第7天显著升高。CellChat分析预测促修复成纤维细胞通过THBS2-CD47（广泛表达）和THBS2-Sdc1（毛囊细胞和角质形成细胞中）进行自分泌和旁分泌通讯。

5. **糖尿病伤口显示中间态成纤维细胞积累和THBS2相关修复程序减弱**
高糖暴露的皮肤类器官中Thbs2表达在第2天短暂升高后下降，而db/db糖尿病小鼠伤口中Thbs2反应显著减弱。基因和蛋白质序列分析显示THBS2在人、小鼠、牛和鸡中高度保守。在人类scRNA-seq数据中，THBS2主要在成纤维细胞中表达。同样应用促修复模块评分，鉴定出三种状态。在正常伤口（NW）中，THBS2在促修复态中表达最高；在糖尿病伤口（DW）中，各状态THBS2表达均低于NW，且促修复态占比下降而中间态显著积累（0.46 vs NW的0.14）。NW促修复态成纤维细胞上调的基因富集于ECM重塑和能量代谢，而DW中THBS2共表达基因缺乏显著的GO富集，表明ECM相关网络解耦。伪时间分析显示DW中THBS2在所有阶段均显著低于NW。JUNB活性在DW中显著降低，而SRF活性在NW和DW间无显著差异。

**讨论与结论**
本研究建立的皮肤类器官多应激平台能够同时解析损伤异质性和同源性反应，揭示了一个保守的再生程序，其细胞体现为Thbs2富集的促修复成纤维细胞状态。在糖尿病伤口中，该状态的功能受损并非由于Thbs2分子本身缺失，而是由于微环境阻碍了成纤维细胞向促修复态的完全转化，导致中间态积累和修复程序解耦。这一发现提示再生医学应转向促进功能细胞状态的恢复，而非单纯靶向单个分子。研究结论总结如下：
**结论**
研究人员的工作提供了一种比较性、多应激的类器官策略，以解析伤口复杂性，并提出了一个以细胞状态转变生物学为中心的新概念框架。通过强调获得一个富含THBS2表达的特定促修复成纤维细胞状态，并展示其在糖尿病伤口中的减弱，研究人员建议从单分子解释转向功能细胞状态恢复。该研究人员的类器官平台可能促进未来筛选调节修复相关成纤维细胞状态的化合物。这一见解将通过细胞重编程重新激活内源性修复程序定位为再生医学的一个有前景的前沿。