《Journal of Advanced Research》：Dual-functional bacterial extracellular vesicles with therapeutic oligonucleotides for synergistic treatment of ischemia/reperfusion injury in the brain
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缺血/再灌注（I/R）损伤是指使用溶栓药物实现再灌注后缺血性卒中发生的继发性损伤。血流突然恢复诱导活性氧（ROS）过量产生、炎症细胞因子释放及免疫细胞浸润，造成额外组织损伤。尽管植物乳杆菌胞外囊泡（LpEVs）的抗炎作用已被研究，但其作为基因递送载体的潜力尚未
缺血/再灌注（I/R）损伤是指使用溶栓药物实现再灌注后缺血性卒中发生的继发性损伤。血流突然恢复诱导活性氧（ROS）过量产生、炎症细胞因子释放及免疫细胞浸润，造成额外组织损伤。尽管植物乳杆菌胞外囊泡（LpEVs）的抗炎作用已被研究，但其作为基因递送载体的潜力尚未被探讨。LpEVs具有抗炎特性和脂质膜结构，有潜力作为基因递送载体。研究人员聚焦于LpEVs能否作为抗miRNA-181a寡核苷酸（AMO181a）的递送载体并对I/R损伤发挥治疗作用。研究人员通过PEG沉淀法分离LpEVs，动态光散射进行物理表征，体外细胞因子实验评价抗炎效果；通过疏水相互作用将胆固醇偶联AMO181a（AMO181a-chol）载入LpEVs，流式细胞术评价Neuro2A细胞递送效率，并在I/R动物模型评价治疗效果。结果显示LpEVs在体外活化巨噬细胞中证实抗炎作用，降低促炎细胞因子，并在I/R动物模型中减小梗死体积；LpEVs递送AMO181a-chol的效率高于裸AMO181a-chol且与AMO181a-chol/聚乙烯亚胺（25 kDa，PEI25k）复合物相当，且LpEVs无细胞毒性；AMO181a-chol负载LpEVs治疗效果优于LpEV单独、裸AMO181a-chol及AMO181a-chol/PEI25k对照组。结论为LpEVs可凭借自身抗炎作用及递送治疗性寡核苷酸的双重功能，用于缺血/再灌注损伤的治疗。
研究背景：缺血性卒中占所有卒中病例约85%，溶栓再灌注虽挽救脑组织，但引发缺血/再灌注（I/R）损伤，表现为活性氧（ROS）暴发、炎症细胞因子上调、免疫细胞浸润及神经元凋亡，扩大梗死体积。既往基因治疗多采用局部注射，临床受限；静脉或鼻内（IN）递送需跨越血脑屏障（BBB）的高效载体。植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）衍生的细菌胞外囊泡（BEVs，特指LpEVs）兼具益生菌抗炎特性与类外泌体纳米囊泡膜结构，且被美国FDA列为GRAS、欧盟EFSA列为QPS，无活菌增殖风险。在I/R中miRNA-181a上调抑制Bcl-2促凋亡，因此拮抗miRNA-181a（AMO181a）与LpEVs抗炎可形成协同。本研究首次评估LpEVs作为AMO181a鼻内递送载体治疗脑I/R损伤的双功能价值。论文发表于《Journal of Advanced Research》。
主要关键技术方法：研究人员采用PEG6000沉淀从植物乳杆菌KCTC 13093培养上清分离LpEVs；以胆固醇修饰反义寡核苷酸AMO181a-chol通过疏水相互作用载药，超声辅助后超滤纯化；以动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）表征粒径、ζ电位与形态；用Neuro2A细胞（小鼠神经母细胞瘤）通过流式与共聚焦评价摄取，MTT与Annexin V评价毒性及凋亡，RT-PCR定量miRNA-181a；体内采用9周龄雄性Sprague Dawley（SD）大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）1 h再灌注模型，经加压嗅递装置（POD）鼻内给予1 μg AMO181a-chol剂量，设预处理（MCAO前1 h）与后处理（再灌注即刻）两组，以TTC染色测梗死体积，免疫荧光测Bcl-2与TNF-α，TUNEL测凋亡，离体荧光成像测Cy5.5标记物脑分布，H&E评主要脏器毒性。
研究结果：
Characterization of AMO181a-chol loaded LpEV：LpEVs呈球形膜结构，载药后粒径由179.2±12.3 nm增至191.3±24.2 nm，ζ电位由?17.7±0.6 mV降至?20±1.9 mV，封装率31.8±13.2%；?80℃稳定至7天，4℃与室温易聚集，提示需低温保存。
In vitro evaluation of LpEVs as a carrier of AMO181a-chol：Neuro2A细胞中AMO181a-chol/LpEV摄取显著高于裸寡核苷酸，与AMO181a-chol/PEI25k相当；LpEVs无细胞毒性，PEI25k显著降低活力并诱导缺氧凋亡；AMO181a-chol/LpEV下调缺氧miRNA-181a水平并抑制凋亡，效果优于PEI复合物。
Biodistribution of AMO181a-chol/LpEV in rats after intranasal administration：鼻内给Cy5.5-AMO181a-chol后2 h，脑内信号LpEV组与PEI组均显著高于裸药组，证实载体增强跨黏膜入脑。
Evaluation of the therapeutic effects of AMO181a-chol/LpEV in an I/R animal model：预处理组脑皮质Bcl-2免疫荧光显示AMO181a-chol/LpEV最强，TUNEL阳性细胞最少，TNF-α最低；TTC示LpEV单药与AMO181a-chol/LpEV均缩梗死体积，后者优于前者及PEI组与裸药组；后处理组24 h与72 h仍见AMO181a-chol/LpEV显著缩梗死且效应维持至亚急性相；H&E未见心肝脾肺肾毒性。
讨论总结：研究人员指出LpEVs较活菌更小易内吞、不增殖、易冻存修饰，表面脂磷壁酸经TLR2促M2极化，其本身即具抗炎与抗凋亡（下调miRNA-181a）基础；疏水插入可拓展至靶向配体或各类疏水修饰核酸/小分子；鼻内途径绕开BBB，LpEVs负电荷利于缺血区扩散优于正电PEI。研究首次证明LpEVs兼具“抗炎药”与“寡核苷酸载体”双功能。
结论翻译：本研究中，研究人员评估了LpEVs作为治疗性试剂及AMO181a-chol鼻内递送入脑载体的表现。结果表明LpEVs具有抗炎效应，减小缺血性卒中梗死体积；同时LpEVs是高效的AMO181a-chol脑内递送载体，降低凋亡。因此AMO181a-chol负载LpEVs可用于缺血性卒中有效治疗并减轻I/R损伤。结果还提示寡核苷酸负载LpEVs经鼻内给药有望拓展至更广脑相关疾病，不止于缺血性卒中。
