念珠菌溶素通过抑制HDAC2介导的GSDMD-K194去乙酰化驱动肠上皮焦亡加剧肠易激综合征

《Journal of Advanced Research》：Candidalysin drives pyroptosis of intestinal epithelium to exacerbate IBS by suppressing HDAC2-mediated deacetylation of GSDMD-K194

　　

摘要
引言：肠道菌群失调参与肠易激综合征（IBS）的发病机制，真菌对IBS患者产生独立于细菌影响的独立作用。IBS患者粪便念珠菌水平升高，但念珠菌在IBS中的具体作用仍不清楚。
目的：本研究探讨了白念珠菌（C. albicans）及其毒素念珠菌溶素对IBS病理生理学的贡献，并阐明了其潜在机制。
方法：研究人员检测了健康对照和腹泻型IBS（IBS-D）患者粪便中的白念珠菌。研究人员对束缚应激小鼠模型灌胃白念珠菌、缺乏念珠菌溶素的白念珠菌突变株（ece1Δ/Δ）或PBS。研究人员对经念珠菌溶素处理的肠道类器官进行RNA-seq并检测焦亡蛋白。研究人员构建了Gsdmd^-/-小鼠以评估念珠菌溶素与焦亡的关系。研究人员采用质谱、免疫共沉淀和乙酰组学分析来表征GSDMD的翻译后修饰。
结果：IBS-D患者中白念珠菌丰度显著高于对照组（31% vs 13%）。白念珠菌通过念珠菌溶素加剧了束缚应激小鼠的屏障破坏、内脏敏感化和炎症。这些病理生理异常在Gsdmd^-/-小鼠中得到减弱。机制上，念珠菌溶素下调肠上皮细胞中的组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2），该酶与GSDMD直接相互作用。乙酰组学分析鉴定GSDMD-K₁₉₄为关键乙酰化位点。药物抑制HDAC2加剧了GSDMD介导的焦亡，该作用被K₁₉₄突变所消除。
结论：念珠菌溶素通过抑制HDAC2介导的GSDMD-K₁₉₄去乙酰化，在体内诱导肠上皮细胞焦亡，从而加剧IBS。这些发现将真菌毒素和HDAC2/GSDMD介导的焦亡定义为IBS的病理生理介质，并提出了靶向真菌组的治疗策略。

**论文解读：念珠菌溶素通过抑制HDAC2介导的GSDMD-K₁₉₄去乙酰化驱动肠上皮焦亡加剧肠易激综合征**

**研究背景与问题**
肠易激综合征（IBS）是一种常见的功能性胃肠疾病，影响全球5.8%–17.5%的人口，其核心特征为反复发作的腹痛伴排便习惯改变。尽管疾病负担沉重，但其病因机制尚不完全清楚，现有治疗手段疗效有限。越来越多的证据表明，肠道真菌菌群失调参与IBS发病，且真菌可独立于细菌对IBS患者产生影响。临床研究显示，IBS患者肠道内白念珠菌（Candida albicans）定植增加，且患者来源菌株表现出更强的菌丝转化能力和上皮侵袭性。白念珠菌的菌丝形态与毒力因子表达相关，特别是由细胞延伸基因1（ECE1）编码的孔形成细胞溶解毒素——念珠菌溶素（candidalysin）。然而，念珠菌溶素在肠道上皮和IBS中的作用尚不明确。细胞死亡方式如焦亡（pyroptosis）已被证明可破坏上皮屏障，且IBS患者中焦亡标志物水平升高，但焦亡在IBS中的功能贡献尚不清楚。因此，本研究旨在探究念珠菌溶素是否通过诱导肠上皮焦亡促进IBS的病理机制。

**研究内容与结论**
研究人员利用束缚应激诱导的IBS小鼠模型，灌胃白念珠菌野生型菌株或缺乏念珠菌溶素的突变株（ece1Δ/Δ），并构建Gsdmd基因敲除（Gsdmd^-/-）小鼠进行机制验证。研究首先发现：IBS-D患者粪便中白念珠菌丰度显著高于健康对照（31% vs 13%），且与腹痛严重程度、疼痛频率和IBS严重程度评分（IBS-SSS）呈正相关。在束缚应激小鼠中，野生型白念珠菌通过念珠菌溶素显著加剧了肠道屏障破坏（紧密连接蛋白Claudin1、Occludin和ZO-1下调，跨上皮电阻降低，FD4通透性增加）、内脏敏感化（腹壁退缩反射评分升高，疼痛阈值降低，肥大细胞-神经元邻近增加）和低度炎症（TNF-α、IL-17、IFN-γ等炎症因子升高，血清TNF-α升高，绒毛高度/隐窝深度比降低）。而ece1Δ/Δ突变株无上述效应。在肠道类器官中，直接施加合成念珠菌溶素可破坏occludin表达。重要的是，Gsdmd基因敲除完全消除了念珠菌溶素介导的上述病理表现，包括屏障功能、内脏敏感性和炎症指标均恢复正常。机制上，念珠菌溶素下调肠上皮细胞中的组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2），而HDAC2与GSDMD直接相互作用。通过乙酰组学分析，研究人员鉴定出GSDMD第194位赖氨酸（K₁₉₄）为关键乙酰化位点。药物抑制HDAC2（使用Santacruzamate A）进一步加剧了念珠菌溶素诱导的细胞毒性（LDH释放）和IL-1β释放，而K₁₉₄突变（K194R）则消除了该效应。HDAC2过表达可逆转念珠菌溶素诱导的焦亡，但该保护作用依赖于GSDMD-K₁₉₄的完整性。此外，研究还发现念珠菌溶素上调HDAC10，但HDAC10不直接结合GSDMD，可能通过间接途径调节GSDMD表达。

**意义**
该研究首次阐明真菌毒素念珠菌溶素通过抑制HDAC2介导的GSDMD-K₁₉₄去乙酰化，驱动肠上皮焦亡，从而加剧IBS。这一发现揭示了真菌毒力因子、表观遗传调控（HDAC2活性）和炎症性细胞死亡（焦亡）在IBS病理中的协同作用，为开发靶向真菌组（mycobiota）的IBS治疗策略提供了新的理论基础。论文发表在《Journal of Advanced Research》。

**关键技术方法**
本研究采用的主要技术方法包括：1）基于粪便宏基因组测序（shotgun metagenomic sequencing）分析IBS-D患者和健康对照的真菌菌群组成；2）建立束缚应激诱导的IBS小鼠模型，并灌胃白念珠菌野生型或ece1Δ/Δ突变株；3）利用Gsdmd基因敲除（Gsdmd^-/-）小鼠进行机制验证；4）采用肠道类器官（organoid）培养体系，结合RNA-seq转录组分析；5）通过免疫共沉淀（Co-IP）和质谱（mass spectrometry）鉴定GSDMD相互作用蛋白及乙酰化位点；6）使用乙酰组学分析（acetylome profiling）和点突变（K194R）验证乙酰化修饰的功能。样本队列来源：35例健康对照和58例腹泻型IBS（IBS-D）患者，均来自武汉和上海的三级医院（2019–2021年招募）。

**研究结果**
**结果1：IBS-D患者粪便白念珠菌升高且与症状正相关**
通过宏基因组测序，IBS-D患者粪便真菌组α多样性降低，β多样性差异显著。白念珠菌在IBS-D患者中丰度显著高于对照（31% vs 13%），且与腹痛严重程度（r=0.268）、疼痛频率（r=0.358）和IBS-SSS评分（r=0.378）呈显著正相关（FDR<0.05）。

**结果2：白念珠菌通过念珠菌溶素加剧束缚应激小鼠的肠道屏障破坏和内脏敏感化**
在束缚应激小鼠中，灌胃野生型白念珠菌显著下调Claudin1、Occludin和ZO-1的mRNA和蛋白水平，降低跨上皮电阻（TEER），增加FD4通透性。而ece1Δ/Δ突变株无效。内脏敏感化评估显示，野生型白念珠菌组AWR评分升高，疼痛阈值降低，肥大细胞-神经元邻近增加。

**结果3：白念珠菌以念珠菌溶素依赖方式诱导低度炎症**
束缚应激小鼠灌胃野生型白念珠菌后，回肠Tnf、Il17、Ifn、Nr3c1 mRNA升高，血清TNF-α升高，绒毛高度/隐窝深度比降低。ece1Δ/Δ突变株无此效应。

**结果4：白念珠菌的致病效应不完全依赖于肠道细菌**
通过广谱抗生素清除肠道细菌后，野生型白念珠菌仍能诱导部分屏障破坏、内脏敏感化和炎症，但效应弱于完整细菌组，表明白念珠菌可独立于细菌发挥致病作用。

**结果5：念珠菌溶素通过焦亡加剧IBS**
RNA-seq显示念珠菌溶素处理类器官激活内吞和吞噬体通路。焦亡标志物（Caspase1-p20、N-GSDMD、IL-1β-p17）在束缚应激+野生型白念珠菌组显著升高，透射电镜观察到肠上皮细胞膜孔形成等焦亡形态特征。

**结果6：GSDMD敲除消除念珠菌溶素介导的致病性**
Gsdmd^-/-小鼠中，野生型白念珠菌无法引起屏障破坏、内脏敏感化和炎症，类器官实验也证实Gsdmd^-/-类器官对念珠菌溶素不敏感。

**结果7：念珠菌溶素抑制HDAC2促进GSDMD乙酰化**
TSA（广谱HDAC抑制剂）增强GSDMD乙酰化，念珠菌溶素进一步强化该效应。免疫共沉淀证实HDAC2与GSDMD直接结合，而非Caspase1。野生型白念珠菌下调肠组织HDAC2表达。

**结果8：念珠菌溶素通过抑制HDAC2介导的GSDMD-K₁₉₄去乙酰化诱导焦亡**
乙酰组学鉴定GSDMD-K₁₉₄为乙酰化位点。K194R突变减弱念珠菌溶素诱导的乙酰化。HDAC2抑制剂（Santacruzamate A）进一步增强念珠菌溶素诱导的LDH释放和IL-1β分泌，该效应被K194R突变消除。HDAC2过表达可逆转念珠菌溶素诱导的焦亡，但依赖于K₁₉₄的完整性。

**结果9：念珠菌溶素通过HDAC10间接触发GSDMD依赖性焦亡**
念珠菌溶素上调HDAC10，但HDAC10不直接结合GSDMD。HDAC10抑制剂可减轻念珠菌溶素诱导的类器官损伤，该保护作用在Gsdmd^-/-类器官中消失。HDAC10抑制选择性降低GSDMD蛋白表达，不影响Caspase1。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究揭示了念珠菌溶素通过抑制HDAC2介导的GSDMD-K₁₉₄去乙酰化，驱动肠上皮焦亡，从而加剧IBS的分子机制。该机制强调了真菌毒力因子、表观遗传调控和炎症性细胞死亡在IBS病理中的协同作用。研究证明，在束缚应激条件下，肠道屏障受损促进念珠菌溶素进入基底侧，并启动焦亡程序。Gsdmd基因敲除完全消除了致病效应，表明GSDMD是念珠菌溶素驱动IBS的关键执行蛋白。此外，HDAC2通过直接去乙酰化GSDMD-K₁₉₄抑制焦亡，念珠菌溶素通过下调HDAC2解除这一抑制。研究还发现HDAC10可能通过间接途径调节GSDMD表达。这些发现为靶向真菌组（如抑制念珠菌溶素或激活HDAC2）治疗IBS提供了新策略。

**结论翻译**
本研究阐明了产生念珠菌溶素的白念珠菌通过抑制HDAC2介导的GSDMD乙酰化和焦亡激活，加剧IBS发病机制。真菌毒力因子、表观遗传调控因子和炎症性细胞死亡通路之间的相互依赖性，凸显了需要全面研究真菌-宿主互作，以开发保护肠道菌群的IBS治疗药物。