靶向IgE Cε2和Cε3结构域的双特异性抗体破坏IgE-FcεRI相互作用

《Journal of Advanced Research》：A biparatopic antibody targeting the Cε2 and Cε3 domains of IgE disrupts IgE-FcεRI interaction

　　

摘要

引言：治疗性抗IgE抗体通过阻断免疫球蛋白E（IgE）与其高亲和力受体（FcεRI）之间的相互作用，一直是过敏性疾病治疗的热门方向。目的：尽管IgE的Cε2和Cε3结构域在稳定IgE:FcεRI复合物中均发挥重要作用，但大多数抗IgE抗体仅靶向IgE的Cε3结构域。在此，研究人员开发了一种靶向IgE Cε2和Cε3结构域的双特异性抗体（SA25-A4-IgG1Fc），该抗体能够破坏IgE-FcεRI相互作用。方法：研究人员通过（GGGGS）₄连接肽将纳米抗体A4和SA25连接，并与人类IgG1Fc标签融合，生成SA25-A4-IgG1Fc。通过酶联免疫吸附测定、流式细胞术、表面等离子体共振以及食物过敏人源化小鼠模型检测SA25-A4-IgG1Fc的FcεRI破坏效应。结果：研究人员鉴定出一种羊驼纳米抗体A4，其以纳摩尔亲和力识别IgE的Cε2结构域；以及一种鲨鱼纳米抗体SA25，其与FcεRI竞争性结合IgE的Cε3结构域。该双特异性抗体（SA25-A4-IgG1Fc）同时靶向IgE的Cε2和Cε3结构域，以皮摩尔亲和力结合IgE，并在体外以比奥马珠单抗更强的效力阻断IgE-FcεRI相互作用。此外，SA25-A4-IgG1Fc还能高效去除人嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的IgE，并在体内抑制IgE/FcεRI人源化小鼠中卵清蛋白（OVA）诱导的IgE依赖性食物过敏。结论：研究结果表明，双特异性抗体SA25-A4-IgG1Fc是治疗食物过敏的一种有前景的抑制剂，并为抗IgE抗体的开发提供了新思路。

**靶向IgE Cε2与Cε3结构域的双特异性抗体：抗IgE治疗策略的创新突破**

**一、研究背景与问题提出**

过敏性疾病在过去几十年中全球患病率持续上升，已影响近30%的人群，成为亟待解决的全球性健康问题。大量研究表明，多数过敏反应由免疫球蛋白E（IgE）介导，而IgE与其高亲和力受体FcεRI的相互作用是过敏反应发生的关键事件。在过敏个体中，过敏原暴露触发肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面IgE结合FcεRI的交联，进而诱导细胞脱颗粒、释放多种介质并启动过敏反应。FcεRI以αβγ₂四聚体形式存在于肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面，通过α链胞外域以高亲和力（K_D≈10^-9-10^-10 M）结合IgE的Fc区。

IgE是典型的异源四聚体，由两条相同的轻链和两条相同的重链组成，每条重链包含四个恒定结构域（Cε1-Cε4）。IgE-Fc具有构象灵活性，FcεRI和CD23识别不同的结合位点，诱导IgE-Fc产生互斥的构象重排。FcεRIα与IgE-Fc3-4不对称结合，在两个Cε3结构域顶部形成两个结合位点；而二聚化Cε2-4片段（IgE-Fc2-4）无论在游离状态还是与FcεRIα结合时均采用不对称弯曲构象，两个Cε2结构域向后折叠并与Cε3和Cε4结构域接触。IgE-Fc2-4与FcεRIα的解离速度比IgE-Fc3-4更慢，提示Cε2结构域在稳定IgE-FcεRI相互作用中发挥重要作用。既往研究已表明，靶向IgE Cε2结构域的抗体可通过使大鼠肥大细胞上预形成的IgE:FcεRIα复合物失稳来预防过敏反应。

目前唯一获批的抗IgE抗体是奥马珠单抗（omalizumab），一种人源化单克隆抗体，与FcεRIα竞争性结合IgE的Cε3结构域。奥马珠单抗在治疗中重度哮喘、慢性自发性荨麻疹和食物过敏方面取得了良好的疗效。然而，并非所有过敏性疾病患者均能从奥马珠单抗治疗中获益，因此开发新型治疗性抗IgE抗体仍十分必要。鉴于Cε2结构域在稳定IgE:FcεRIα复合物中的重要作用，同时靶向Cε2和Cε3结构域的双特异性抗体策略有望提供更优的阻断效果。

**二、研究内容概述**

研究人员通过免疫羊驼和鲨鱼，利用噬菌体展示技术筛选获得两种新型纳米抗体：识别IgE Cε2结构域的羊驼纳米抗体A4和识别Cε3结构域的鲨鱼纳米抗体SA25。通过（GGGGS）₄连接肽将SA25连接至A4的N端，并与人类IgG1Fc标签融合，构建了四价双特异性抗体SA25-A4-IgG1Fc。研究系统评估了该抗体在体外阻断IgE-FcεRI相互作用、去除细胞表面已结合IgE的能力，并在IgE/FcεRI人源化小鼠模型中验证了其对食物过敏的抑制作用。

**三、关键技术方法**

本研究主要运用以下关键技术方法：（1）表面等离子体共振（SPR）技术，用于精确测定抗体与不同构象IgE-Fc片段（IgE-Fc2-4、IgE-Fc3-4、IgE-Fc3-4-M、IgE-Fc2、IgE-Fc4）及各突变体（IgE-Fc3-4-D330A、IgE-Fc3-4-R427A、IgE-Fc3-4-R427A/A428I）的结合动力学参数；（2）竞争性酶联免疫吸附测定（ELISA），用于评估抗体阻断IgE-Fc2-4与FcεRIα结合的能力；（3）流式细胞术，用于检测抗体对KU812人嗜碱性粒细胞系及骨髓来源肥大细胞表面IgE-Fc2-4:FcεRI复合物的破坏和结合抑制效果；（4）AlphaFold2结构预测结合PDBePISA分析及点突变验证，用于解析SA25与IgE-Fc3的结合界面；（5）IgE/FcεRI双转基因人源化小鼠（BALB/c背景）的OVA诱导食物过敏模型，用于体内药效评估。样本来源包括HEK293F细胞表达的重组蛋白、人KU812细胞系（中国典型培养物保藏中心）及人源化转基因小鼠。

**四、研究结果**

**（一）羊驼纳米抗体A4结合IgE的Cε2结构域**

SPR分析显示，A4-IgG1Fc以高亲和力（K_D = 3.18 × 10^-11 M）结合弯曲构象的IgE-Fc2-4，但不识别IgE-Fc3-4或IgE-Fc3-4-M，且能结合Cε2结构域二聚体（IgE-Fc2）而非Cε4结构域（IgE-Fc4），证实A4靶向IgE的Cε2结构域。A4-IgG1Fc与IgE-Fc2-4的相互作用比奥马珠单抗强约15倍，主要得益于约80倍更慢的解离速率。然而，竞争性ELISA显示A4-IgG1Fc的最大抑制率仅约30%，远低于奥马珠单抗的约80%，因其靶向Cε2结构域而非FcεRIα直接结合的Cε3结构域。

**（二）鲨鱼纳米抗体SA25结合IgE的Cε3结构域**

SA25-IgG1Fc结合IgE-Fc3-4的亲和力与奥马珠单抗相当，但不结合IgE-Fc2或IgE-Fc4，且对IgE-Fc2-4和IgE-Fc3-4-M的相对响应值显著低于IgE-Fc3-4，表明SA25仅识别开放构象的Cε3结构域。AlphaFold2结构预测结合定点突变验证表明，SA25主要通过其CDR3区域结合Cε3结构域，其中S90和W91与Cε2-Cε3连接肽（D330）形成两个氢键，与FG环（R427和A428）形成三个氢键。虽然重叠结合位点仅涉及一个氨基酸（R427），但SA25-IgG1Fc确实与FcεRIα竞争IgE残基，其最大抑制率约20%，低于奥马珠单抗。

**（三）双特异性抗体SA25-A4-IgG1Fc增强阻断IgE与FcεRIα结合的效果**

研究人员构建了两种四价双特异性抗体A4-SA25-IgG1Fc和SA25-A4-IgG1Fc。竞争性ELISA显示，SA25-A4-IgG1Fc的最大抑制率约80%，达到奥马珠单抗水平，且IC₅₀值约为奥马珠单抗的一半，表现出更优的体外阻断效果，显著优于A4-IgG1Fc和SA25-IgG1Fc。而A4-SA25-IgG1Fc的最大抑制率仅约40%。SPR分析表明，SA25-A4-IgG1Fc以皮摩尔亲和力（K_D = 2.72 × 10^-12 M）结合IgE-Fc2-4，比奥马珠单抗强约182倍，主要归因于约7900倍更慢的解离速率。SA25-A4-IgG1Fc同时保留了对IgE-Fc2和IgE-Fc3-4的亲和力，但不结合闭合构象的IgE-Fc3-4-M，证实其同时靶向Cε2和开放构象Cε3结构域。结构预测结果解释了两者差异：SA25的C端更靠近Cε2结构域，因此SA25-A4-IgG1Fc的排列方式更有利于A4和SA25同时结合IgE-Fc2-4。

**（四）双特异性抗体SA25-A4-IgG1Fc更高效降低嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面IgE-Fc2-4水平**

流式细胞术实验表明，在KU812细胞上，SA25-A4-IgG1Fc以剂量依赖性方式减少细胞表面IgE-Fc2-4水平，效果优于A4-IgG1Fc、SA25-IgG1Fc和奥马珠单抗。在骨髓来源肥大细胞上，SA25-A4-IgG1Fc处理导致细胞表面IgE-Fc2-4的剂量依赖性去除，而奥马珠单抗几乎无此效果。当预先将IgE-Fc2-4与抗体孵育后再加入肥大细胞时，SA25-A4-IgG1Fc抑制IgE-FcεRI相互作用的效率优于奥马珠单抗。

**（五）双特异性抗体SA25-A4-IgG1Fc抑制IgE/FcεRI人源化小鼠中OVA诱导的IgE依赖性食物过敏**

在IgE/FcεRI双转基因人源化小鼠模型中，SA25-A4-IgE1Fc和奥马珠单抗处理均显著减少了OVA攻击后核心体温的最大下降幅度。同时，两种抗体均抑制了OVA特异性IgE、组胺和肥大细胞蛋白酶-1（Mcpt-1）的血清水平，表明SA25-A4-IgG1Fc能有效抑制由嗜碱性粒细胞和肥大细胞介导的组胺和肥大细胞蛋白酶释放。

**五、讨论与结论**

本研究表明，与仅靶向Cε3结构域的传统抗IgE抗体（如奥马珠单抗）相比，同时靶向Cε2和Cε3结构域的双特异性抗体SA25-A4-IgG1Fc具有多重优势：一方面，A4对Cε2结构域的高亲和力结合赋予了抗体对IgE的皮摩尔级亲和力；另一方面，SA25对Cε3结构域上与FcεRIα重叠表位的识别使其能够直接竞争性阻断IgE-FcεRI相互作用。与DARPin E2_79和C03系列抗体仅识别Cε3结构域不同，SA25-A4-IgG1Fc额外识别Cε2结构域，可能通过A4先结合FcεRI结合位点外的Cε2结构域，再招募SA25竞争FcεRI结合位点，从而加速IgE从FcεRI的解离。

结论：研究人员鉴定出两种新型抗IgE抗体A4和SA25，分别靶向IgE的Cε2和Cε3结构域，并成功构建了双特异性抗体SA25-A4-IgG1Fc。该抗体在体外和体内均以优于奥马珠单抗的效率破坏IgE-FcεRI相互作用。该研究为过敏性疾病抗IgE治疗药物的开发提供了同时靶向Cε2和Cε3结构域的新策略。