肠道微生物代谢物的口服纳米递送增强T细胞干性用于癌症免疫治疗

《Nature Nanotechnology》：Oral nano-delivery of a gut microbial metabolite enhances T cell stemness for cancer immunotherapy

　　

肠道微生物代谢物在调节系统性免疫中发挥关键作用，但其机制和有限的药物样属性仍未解决。研究人员在此报告一种口服纳米制剂，利用肠道微生物代谢物调节T细胞代谢并增强抗肿瘤免疫。通过体外筛选肠道微生物代谢物，研究人员鉴定出3,4-二羟基苯甲酸（3,4-dihydroxybenzoic acid, DHB），该化合物通过抑制糖酵解和调控Akt-mTORC1-Myc通路，改善了过继性T细胞疗法并增强了CD8⁺ T细胞干性。为利用3,4-二羟基苯甲酸（DHB）的效力进行系统性癌症免疫治疗，研究人员设计了一种DHB前药纳米乳剂，显著提高了其口服吸收和半衰期。在多种小鼠肿瘤模型中，该口服纳米乳剂增强了抗原特异性、干细胞样CD8⁺ T细胞的扩增，使肿瘤对α-PD-1免疫检查点阻断敏感，并发挥强大的抗肿瘤功效。通过将纳米技术与基于微生物代谢物的免疫疗法相结合，本研究建立了肠道微生物群与T细胞免疫之间的机制联系，为癌症免疫治疗提供了一种有前景的方法。

**论文解读：口服纳米递送肠道微生物代谢物增强T细胞干性用于癌症免疫治疗**

**研究背景与问题**
肠道微生物代谢物在调节系统性免疫中扮演关键角色，但其作用机制及药物样属性不足的问题尚未解决。免疫检查点阻断（ICB）抗体虽革新了癌症免疫治疗，但患者总体响应率低仍是主要挑战。新兴证据表明，微生物代谢物通过调控T细胞表型和效应功能，介导肠道微生物群与系统性免疫的串扰，提示其改善抗肿瘤免疫的治疗潜力。然而，微生物代谢物在T细胞免疫和适应性中的具体作用，尤其在ICB治疗背景下，仍待探索。研究人员此前报道口服菊粉凝胶通过肠道微生物群–短链脂肪酸（SCFAs）–CD8⁺ T细胞轴增强抗肿瘤免疫，并观察到菊粉凝胶显著改变了非SCFA微生物代谢物谱，进而假设这些代谢物可能调控T细胞免疫。此外，多数微生物代谢物亲水性强、分子量低，口服吸收差、药代动力学（PK）特性不佳（半衰期短、清除率高），限制了其在体内对T细胞免疫的有效调节。因此，开发一种能改善微生物代谢物药物样属性并利用其调控T细胞免疫的策略具有重要科学意义。

**研究内容与结论**
研究人员在《Nature Nanotechnology》上发表论文，报告了一种基于肠道微生物代谢物3,4-二羟基苯甲酸（DHB）的口服前药纳米乳剂，通过调控T细胞代谢增强干细胞样CD8⁺ T细胞分化，进而放大抗肿瘤免疫。体外筛选确定DHB为关键代谢物，通过抑制糖酵解和调控Akt-mTORC1-Myc通路，促进记忆T细胞生成。为改善DHB的口服吸收和PK特性，研究人员将其合成为前药并制成纳米乳剂（Prodrug 201），显著延长半衰期、提高生物利用度。在多种ICB耐药小鼠肿瘤模型（包括CT26、B16F10、NOOC1、自发结肠癌和乳腺癌模型）中，口服Prodrug 201联合α-PD-1抗体治疗诱导抗原特异性干细胞样CD8⁺ T细胞扩增，增强肿瘤对ICB的敏感性，发挥强效抗肿瘤作用，并建立长期免疫记忆。此外，DHB体外处理可增强过继性T细胞疗法（ACT）的疗效。该研究首次展示基于微生物代谢物的口服药物设计，为改善干细胞样T细胞免疫提供了新路径，并建立了肠道微生物群与T细胞免疫的机制联系。

**关键技术方法**（不超过250字）
研究人员采用体外筛选体系（从菊粉凝胶处理小鼠粪便代谢组学数据中选取非SCFA代谢物，与OT-I CD8⁺ T细胞共培养）鉴定DHB。利用靶向代谢组学分析、Seahorse生物能量分析、免疫印迹、流式细胞术评估DHB对T细胞代谢和分化的影响。通过三重四极杆串联质谱（QqQ-MS/MS）鉴定DHB与还原型谷胱甘肽（GSH）的加合物。采用批量RNA测序（RNA-seq）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）及单细胞转座酶可及性染色质测序（scATAC-seq）解析转录和表观遗传调控。前药合成后，以油酸/吐温80制备口服纳米乳剂，并在大鼠中评估PK参数。肿瘤模型包括CT26皮下瘤、B16F10黑色素瘤、NOOC1鳞状细胞癌、CDX2-Cre NLS-APC^fl/fl自发结肠癌模型及MMTV-PyMT乳腺癌模型（均来源于小鼠）。过继性T细胞疗法使用OT-I小鼠来源的CD8⁺ T细胞，在B16F10-OVA和NOOC1-OVA模型中进行验证。

**研究结果**
1. **DHB诱导干细胞样CD8⁺ T细胞分化**：通过体外共培养筛选，DHB显著增加CD44⁺CD62L⁺中央记忆T（Tcm）细胞和Tcf1⁺ CD8⁺ T细胞频率，维持IL-2撤除后的细胞活力，促进抗原再刺激时的IFN-γ回忆反应，上调Sca-1和Foxo1表达，降低Foxo1磷酸化，且DHB异构体中仅DHB增强IL-2分泌。

2. **DHB重编程T细胞代谢并促进干性**：靶向代谢组学显示DHB降低糖酵解、谷氨酰胺分解和三羧酸循环中间代谢物，Seahorse实验证实DHB抑制体内外CD8⁺ T细胞胞外酸化率（ECAR）。代谢抑制剂实验表明，2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）模拟DHB的Tcm诱导效应，而寡霉素不抑制DHB组，提示糖酵解抑制是关键。DHB通过与GSH形成迈克尔加成加合物（经QqQ-MS/MS证实）降低细胞内GSH水平，进而下调Akt-mTORC1-Myc通路（免疫印迹），抑制糖酵解。批量RNA-seq显示DHB上调干细胞相关基因（Ly6a、Ccr7、Sell、Tcf7）；scRNA-seq鉴定出两个干细胞样CD8⁺ T细胞簇（簇3和簇6），高表达Tcf7、Sell、Tox等；scATAC-seq显示这些簇中Tcf7、Sell、Ccr7基因座染色质可及性增加，而Pdcd1和Icos可及性降低。基因集富集分析（GSEA）进一步证实糖酵解和缺氧通路下调。

3. **口服DHB前药201增强α-PD-1疗效**：在ICB耐药自发结肠癌模型中，口服DHB联合α-PD-1减少肿瘤负荷。在CT26皮下瘤模型中，直接瘤内注射DHB可协同α-PD-1，但口服DHB无效，提示需优化口服递送。合成7种DHB前药，其中前药201（Prodrug 201）纳米乳剂（约160 nm，均一球形）在CT26模型中显著增强α-PD-1疗效，提高AH1特异性CD8⁺ T细胞频率。PK研究显示，口服Prodrug 201使DHB血浆半衰期从0.4 h延长至4.1 h，最大血药浓度（C_max）提高5.2倍，曲线下面积（AUC）提高14.3倍，口服生物利用度（%F）提高9.72倍。在NOOC1、B16F10、MMTV-PyMT模型中，Prodrug 201联合α-PD-1均显著抑制肿瘤生长。

4. **Prodrug 201促进抗原特异性干细胞样CD8⁺ T细胞**：在CT26模型中，联合治疗抑制肿瘤生长、延长生存期，且肿瘤治愈小鼠在90天后对侧再接种完全抵抗。CD8⁺ T细胞清除实验证实CD8⁺ T细胞是关键效应细胞。联合治疗增加PBMC中AH1特异性CD8⁺ T细胞、Tcm和Tem细胞频率，增强IFN-γ ELISPOT响应。肿瘤微环境（TME）中，联合治疗提高IFN-γ、CXCL10和颗粒酶B水平，增加CD45⁺白细胞、CD3⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞浸润，提高M1/M2巨噬细胞比值，降低Treg比例。TME中AH1特异性CD8⁺ T细胞表现出CD44⁺CD62L⁺、Tcf1⁺、Foxo1⁺、Sca-1⁺PD-1^?等干细胞样表型。肿瘤引流淋巴结（tdLN）中，联合治疗增加AH1特异性CD44^?CD62L⁺和CD44⁺CD62L⁺细胞，以及Sca-1⁺PD-1^?干细胞样CD8⁺ T细胞。

5. **DHB改善过继性T细胞免疫治疗**：DHB体外处理OT-I CD8⁺ T细胞，增加CD127⁺PD-1^?（长寿记忆）细胞亚群，并上调Foxo1、Tcf1和Ki67表达。过继转移DHB训练的OT-I CD8⁺ T细胞至B16F10-OVA荷瘤小鼠，显著延缓肿瘤生长，部分小鼠完全消退，且肿瘤微环境中Thy1.1⁺（转移）CD8⁺ T细胞浸润和Ki67表达增加。在NOOC1-OVA模型中亦有类似结果。口服Prodrug 201原位增强过继性T细胞疗效，且RNA-seq显示肿瘤浸润OT-I CD8⁺ T细胞中糖酵解、炎症信号、氧化应激和功能障碍相关基因下调。

**总结与讨论**
研究人员成功合成了基于DHB的前药纳米乳剂，并证明口服前药治疗在体内诱导抗原特异性干细胞样T细胞反应，在多种ICB耐药小鼠肿瘤模型中放大α-PD-1免疫治疗的疗效。据研究人员所知，这是首个基于微生物代谢物的口服药物设计，旨在改善干细胞样T细胞免疫。该口服前药制剂具有明确的组成和化学结构，有利于大规模生产、质量控制和患者依从性，凸显其强大的转化潜力。更广泛而言，由于微生物代谢物在宿主-免疫相互作用中发挥关键作用并与多种免疫相关疾病相关，本研究为利用微生物代谢物进行创新药物发现和开发提供了通用途径。研究结论总结：研究人员合成了DHB衍生的前药纳米乳剂，并证明口服前药治疗在体内诱导抗原特异性干细胞样T细胞反应，在多种ICB耐药小鼠肿瘤模型中放大了α-PD-1免疫治疗的疗效。这是首个基于微生物代谢物的口服药物，旨在改善干细胞样T细胞免疫。该口服前药制剂具有明确的组成和化学结构，有利于大规模生产、质量控制和患者依从性，凸显其强大的转化潜力。更广泛而言，由于微生物代谢物在宿主-免疫相互作用中发挥关键作用并与多种免疫相关疾病相关，本研究为利用微生物代谢物进行创新药物发现和开发提供了通用途径。