《Journal of Biological Chemistry》：A ternary association of KRas, EphA2 and integrins controls PDAC cell behaviour
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胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的癌症之一，主要原因在于其晚期检出、缺乏有效治疗手段以及丰富的促结缔组织增生反应导致增殖、侵袭和免疫逃逸增强。KRas是PDAC中最常见的突变驱动基因，尽管目前已有针对该GTPase的药物可用，但仍需更多药理学选择来治疗该疾病。
胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的癌症之一，主要原因在于其晚期检出、缺乏有效治疗手段以及丰富的促结缔组织增生反应导致增殖、侵袭和免疫逃逸增强。KRas是PDAC中最常见的突变驱动基因，尽管目前已有针对该GTPase的药物可用，但仍需更多药理学选择来治疗该疾病。作为识别潜在靶点的第一步，本研究旨在利用邻近蛋白质组学定义KRas的分子环境。研究人员在多种PDAC细胞系和类器官中稳定表达了KRasG12V-生物素连接酶嵌合体，并在添加生物素后通过链霉亲和素亲和分离和质谱（MS）鉴定关联蛋白。在所有细胞系中特异性关联的126种蛋白质中，五种整合素亚基和受体酪氨酸激酶ephrin type-A受体2（EphA2）持续富集。这两类受体此前均已被证实与Ras信号传导和促结缔组织增生反应有关。一系列蛋白质生化和显微分析证实了整合素β1和EphA2与KRas的空间关联。在耗尽整合素β1和EphA2后，细胞KRas水平降低，且EphA2的耗竭抑制了KRas依赖性迁移。综上所述，这些发现揭示了受体酪氨酸激酶、整合素和KRas信号传导之间的三元串扰，为PDAC进展提供了见解，并标示了潜在的治疗脆弱性。
**KRas、EphA2与整合素三元关联调控胰腺导管腺癌（PDAC）细胞行为的论文解读**
**研究背景与问题**
胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是致死率最高的恶性肿瘤之一，五年总生存率仅约10%。其高致死性主要归因于晚期诊断、有效治疗手段匮乏以及显著的促结缔组织增生反应（desmoplastic response），后者通过增加基质硬度驱动肿瘤增殖与侵袭，并营造免疫抑制微环境。KRas是PDAC中突变频率最高的驱动基因，见于超过90%的病例，其持续激活通过MAP激酶（MAPK）和PI-3激酶（PI3K）/Akt等信号通路促进肿瘤生长、存活与进展。尽管首个靶向KRas G12C突变的抑制剂已获批临床使用，但该突变在PDAC中频率较低，针对其他突变或KRas ON状态的抑制剂尚处于研发阶段。因此，识别新的治疗靶点以阻断致癌KRas信号传导仍存在未满足的临床需求。此外，PDAC肿瘤富含细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）成分，整合素受体作为ECM的主要感知者，其表达与PDAC预后呈负相关；同时，包括ephrin受体家族成员在内的多种受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinases, RTKs）表达亦与PDAC不良预后相关。既往邻近生物素化研究虽已描绘KRas相互作用组，但尚未探索这些相互作用的功能相关性。本研究旨在通过邻近蛋白质组学在多种PDAC细胞系中获取KRas分子环境的共识性定义，并进一步验证候选蛋白的关联及其功能意义。
**研究内容与结论**
研究人员采用邻近生物素化（Proximity biotinylation, BioID）技术，在KRasG12V-生物素连接酶嵌合体稳定表达的PDAC细胞系（KP4、Suit-2）及永生化正常胰腺上皮细胞系（h6c7）中鉴定KRas关联蛋白组。通过链霉亲和素亲和分离、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析及SAINTexpress统计学筛选（贝叶斯错误发现率≤0.05，倍数变化>10），共鉴定出126种在所有细胞系中共同富集的蛋白质。无偏k-means聚类揭示四组具有不同关联模式的蛋白簇，其中包含质膜相关蛋白、已知KRas相互作用因子（RAF1、BRAF、ARAF、AFDN、SNAP23、VAMP2）、RTK信号蛋白（EPHA2、EGFR）、黏附受体及调控因子（整合素ITGA2、ITGA3、ITGA6、ITGB1、ITGB5，FERMT2，CTNND1，CD44，YES1，PTPRJ）等。基因本体（Gene ontology, GO）富集分析显示，细胞组分类别中最富集的为质膜不同区域、黏着斑、细胞-基质连接和黏附连接；生物学过程包括细胞-基质相互作用、整合素信号传导、钙黏蛋白结合以及跨膜蛋白和营养转运。在PDAC类器官模型中，研究人员使用携带KRasG12D突变并伴有p53功能获得性突变（R172H）或p53敲除的鼠源类器官重复BioID实验，鉴定出95种差异蛋白，其中包含经典KRas相互作用因子（Raf1、b-Raf、a-Raf、afadin/MLLT4、EGFR）、整合素（α6、β1、β4）和ephrin受体（EphA2、EphB2）。功能富集分析显示最富集的GO术语为黏着斑、细胞-基质连接、肌动蛋白细胞骨架和黏附连接。细胞系与类器官数据共同确立了以细胞黏附和RTK信号相关蛋白为主的KRas关联蛋白共识集。
在候选验证阶段，研究人员通过Raf1-RBD拉下实验证实内源性活性KRas能够与整合素β1和EphA2共沉淀。共聚焦免疫荧光成像显示，在层粘连蛋白包被的基质上，KRas、EphA2和整合素β1在细胞外周近膜区域呈点状共定位；全内反射荧光（Total internal reflection fluorescence, TIRF）显微镜进一步证实三者于细胞-基质界面重叠分布，以桩蛋白（Paxillin）作为整合素黏附复合物阳性标志。邻近连接实验（Proximity ligation assay, PLA）定量了蛋白对间的关联强度，KRas-EphA2相互作用强于KRas-整合素β1或EphA2-整合素β1。在KRasG12D PDAC类器官中亦观察到类似的高程度共定位模式。
功能研究表明，EphA2在调控KRas和整合素β1水平中发挥核心作用。siRNA介导的EphA2敲低使EphA2蛋白减少78%，并显著降低Ras（减少55%）和整合素β1（减少44%）的表达；整合素β1敲低使Ras减少35%，但对EphA2影响甚微（仅减少8%）；KRas敲低使EphA2减少52%，对整合素β1无显著影响。外源性YFP-EphA2表达能够挽救EphA2敲低导致的Ras表达下降。Boyden小室迁移实验表明，EphA2耗竭在Suit-2（突变KRas）和U2OS（野生型KRas）细胞中均显著抑制细胞迁移能力。
机制探索方面，研究人员采用候选蛋白策略检验Shc1是否作为连接分子。免疫共沉淀实验显示，YFP标记的EphA2能够与整合素β1和Shc1共沉淀，但未检测到KRas。共聚焦免疫荧光分析显示KRas、Shc1和整合素β1在Suit-2细胞中呈显著点状重叠。运用自定义CellProfiler图像分析流程定量Shc1敲低后的共定位变化，结果表明Shc1耗竭破坏了EphA2与整合素β1的相互作用，导致KRas在细胞边缘1 μm区域内的表达丧失，并降低了EphA2-KRas共定位程度。
该研究论文发表于《Journal of Biological Chemistry》。研究结论可概括为：KRas在二维细胞和三维类器官培养中与一组具有信号转导、黏附、细胞骨架组织、代谢和蛋白转运功能的共同蛋白集合关联；KRas、EphA2和整合素β1形成由EphA2主导、Shc1连接的三元关联；EphA2耗竭抑制KRas依赖性迁移。这些发现揭示了RTK、整合素和KRas信号通路间的三元串扰机制，为理解PDAC进展提供了新视角，并标示了潜在的治疗靶点。
**关键技术方法**
本研究主要运用以下关键技术：（1）邻近生物素化（BioID）结合链霉亲和素亲和分离和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定KRas邻近蛋白组；（2）Raf1-RBD拉下实验检测活性KRas关联蛋白；（3）共聚焦免疫荧光、全内反射荧光（TIRF）显微镜和邻近连接实验（PLA）验证蛋白共定位；（4）siRNA介导的基因敲低结合蛋白质印迹评估蛋白表达调控；（5）Boyden小室迁移实验评估细胞迁移能力；（6）免疫共沉淀（GFP pull-down）验证蛋白间物理关联；（7）细胞系来源包括人PDAC细胞系KP4（KRasG12D）和Suit-2（KRasG12D, CDKN2AH83Y, TP53R273H）、永生化正常胰腺上皮细胞系h6c7及人子宫肉瘤细胞系U2OS；鼠源PDAC类器官TJ1365（KrasG12D/+, Trp53KO）和TJ4124（KrasG12D/+, Trp53R172H/+）由Tyler Jacks博士（MIT）惠赠。
**研究结果**
**PDAC细胞系中致癌KRas相互作用组的定义**：对KP4和Suit-2细胞进行BioID实验，以h6c7作为对照，经SAINTexpress筛选（BFDR≤0.05，FC>10）鉴定出126种共有蛋白。k-means聚类分为四组，其中簇3和簇4为通用性关联蛋白，主要包括已知KRas相互作用因子、RTK信号蛋白和整合素。GO富集分析显示细胞组分集中于质膜、黏着斑和细胞-基质连接。离子强度分析显示整合素亚基、EphA2及kindlin-2在KRas表达样本中显著高于对照。
**PDAC类器官中致癌KRas相互作用组的定义**：在p53GF和p53KO两种基因型类器官中重复BioID实验，鉴定出95种差异蛋白，包含Raf1、b-Raf、a-Raf、afadin、EGFR、整合素（α6、β1、β4）和ephrin受体（EphA2、EphB2）。GO富集分析显示黏着斑、细胞-基质连接和肌动蛋白细胞骨架为最富集细胞组分。EphA2和ITGB1的离子强度仅在KRas表达样本中检测到。
**PDAC细胞系中候选蛋白与KRas关联的验证**：Raf1-RBD拉下实验证实整合素β1和EphA2与活性KRas共沉淀。共聚焦和TIRF显微镜显示三者于细胞外周和腹侧质膜呈点状共定位，PLA定量显示KRas-EphA2关联强度高于KRas-整合素β1或EphA2-整合素β1。类器官中共定位模式与细胞系一致。
**EphA2调控KRas和整合素β1水平**：EphA2敲低导致Ras减少55%和整合素β1减少44%；整合素β1敲低使Ras减少35%但对EphA2影响甚微；KRas敲低使EphA2减少52%但不影响整合素β1。外源性EphA2表达可挽救Ras水平。EphA2耗竭在Suit-2和U2OS细胞中均显著抑制迁移。
**Shc1连接EphA2、KRas和整合素β1**：GFP pull-down显示EphA2与整合素β1和Shc1共沉淀。共聚焦分析显示KRas、Shc1和整合素β1显著共定位。Shc1敲低破坏EphA2-整合素β1相互作用，导致KRas膜定位丧失并降低EphA2-KRas共定位。
**讨论与结论**
研究讨论指出，整合素β1是本研究中在PDAC细胞系和类器官中统计学显著性最高的整合素亚基，其配对α亚基（α2、α6）和效应分子kindlin-2亦被检测到。既往邻近蛋白质组学虽报道过整合素和RTK为KRas关联蛋白，但未探索其功能相关性。本研究的免疫荧光分析确定三者确实在细胞中共定位，其中KRas-EphA2共定位程度最高。蛋白生化实验证实整合素β1和EphA2与活性KRas共沉淀，表明各候选蛋白至少瞬时存在于同一复合物中。EphA2敲低降低KRas和整合素β1表达、整合素β1敲低降低KRas表达的结果提示KRas与任一受体的关联可稳定其在质膜的存在。鉴于EphA2过表达与PDAC不良预后相关，并可通过反馈环机制促进MAPK通路激活以调控KRas依赖性细胞系生长，本研究数据支持EphA2在PDAC中作为KRas上游正调控因子的观点。Shc1作为一种衔接蛋白，可被RTK和整合素募集以激活MAPK和Akt通路。本研究显示EphA2可与整合素β1和Shc1共沉淀，且Shc1耗竭足以破坏EphA2-整合素β1相互作用，同时导致膜定位KRas丧失，提示Shc1在连接EphA2与整合素β1及KRas信号传导中发挥关键作用。
研究结论部分翻译：本研究的主要发现为：（a）KRas在二维人源细胞和三维类器官培养中与一组在信号转导、黏附、细胞骨架组织、代谢和蛋白转运中具有既定功能的共同蛋白集合关联；（b）KRas、EphA2和整合素β1受体形成由EphA2主导、Shc1连接的三元关联；（c）EphA2耗竭抑制KRas依赖性迁移。这些发现揭示了KRas信号传导与RTK及整合素通路在PDAC中的整合机制，为理解PDAC进展和开发新的治疗策略提供了重要见解。
