在体相及气-水界面中依那西普与免疫球蛋白G1的蛋白质-蛋白质相互作用及自聚集：NaCl和蔗糖的影响

《Journal of Colloid and Interface Science》：Protein–Protein Interactions and Self-Association of Etanercept and Immunoglobulin G1 in the Bulk Phase and at the Air–Water Interface: Effects of NaCl and Sucrose

　　摘要
假设：治疗性蛋白质的自我聚集仍是生物制药研发中的重大挑战，因为它会降低药物效力并引发免疫反应。这类蛋白质-蛋白质相互作用既可能发生在溶液整体中，也可能发生在界面处。人们通常使用盐类和糖类等辅料来调节蛋白质稳定性，但它们的效果会因蛋白质种类及溶液条件的不同而有所差异。

实验
在本研究中，我们研究了在蔗糖和NaCl这两种辅料存在的情况下，融合蛋白Enbrel与结构相似的IgG1单克隆抗体在溶液整体以及气-水界面处的蛋白质-蛋白质相互作用及自我聚集行为。我们通过表面张力等温线、界面流变学以及浓度依赖型动态光散射技术，分析了这两个环境中的蛋白质稳定性及相互作用情况。

研究结果
我们的研究表明，辅料的作用具有很强的蛋白质及作用环境依赖性。在溶液整体中，NaCl会减弱Enbrel分子间的吸引作用，而增强IgG1溶液中的这种作用。此外，蔗糖在溶液整体中会降低蛋白质间的吸引作用，但在气-水界面处则能促进Enbrel分子间的聚集。总体而言，这些发现为理解辅料如何影响蛋白质相互作用提供了机制上的解释，也有助于为结构复杂的生物制剂设计合理的配方。

引言
单克隆抗体属于生物制药的一个类别，已被广泛用于治疗多种疾病，包括癌症、炎症、心血管疾病以及自身免疫性疾病[1][2][3]。这类蛋白质是在实验室中设计的，旨在与与疾病相关的靶标结合。由于其高特异性和高效力，单克隆抗体已成为过去几十年中发展最快的治疗药物类别之一。从结构上看，单克隆抗体呈Y形，由两条轻链和两条重链组成，整体结构可划分为三个部分：两个抗原结合片段（Fab段）和一个可结晶片段（Fc段）[4]，这些部分通过一个灵活的铰链区域相连，从而使Fab段能够移动。Fc段和Fab段具有不同的功能：Fc段通常通过与免疫细胞相互作用来激活免疫系统，而Fab段则负责与目标抗原结合[5]。在某些情况下，这些蛋白质结构域中的一个可以与另一个蛋白质结构域通过基因融合的方式结合，从而形成具有多种功能的单一蛋白质，即融合蛋白[6][7]。依那西普（Enbrel?）就是一种这样的融合蛋白，它是由人类可溶性肿瘤坏死因子受体2的细胞外配体结合结构域与人类免疫球蛋白IgG1的Fc段融合而成的[8]。IgG1的Fc段可以延长蛋白质在血液中的半衰期，而TNF受体结构域则能与可溶性的TNF-α和TNF-β结合，阻止它们与细胞表面的TNF受体发生作用。由于Enbrel与IgG1在结构上的相似性，我们可以比较二者的行为，进而了解Enbrel中的TNF-R2结构域如何影响分子间相互作用。正是基于对这种关系的理解，我们开展了这项研究。

在治疗性蛋白质溶液的制造和储存过程中，包括单克隆抗体和融合蛋白，一个重大挑战就是由物理和化学应力因素引起的分子不稳定性[9]。其中，蛋白质在气-液、液-液或固-液界面处的吸附所导致的聚集现象属于物理不稳定性的一种，是一种不良现象，也是许多研究的重点。蛋白质聚集通常是不可逆的[10]，可能会带来诸多风险，如引发患者的不良免疫反应、降低药物效力，以及导致蛋白质损失，从而使给药剂量低于治疗水平[11]。因此，了解蛋白质聚集的过程及其影响因素，并探索有效的缓解策略至关重要。

由于气体、液体或固体相的物理性质存在差异，界面类型会显著影响蛋白质的吸附和聚集行为。在本研究中，我们重点探讨了在制造和储存过程的各个阶段可能形成的气-水界面处蛋白质的行为，这些阶段包括混合、机械泵送操作、运输过程中的搅拌，以及药物溶液容器中存在的气相空间[11]。由于疏水作用、静电作用以及氢键等相互作用，蛋白质在气-水界面处尤其容易发生聚集[12][13]。这些因素也会促使蛋白质在溶液整体中发生自我聚集[14]，不过，界面处蛋白质的潜在机制及构象状态可能与溶液内部有所不同。提高蛋白质稳定性的常见方法之一是添加糖类和盐类等辅料。这类添加剂可以通过调节分子间相互作用来稳定蛋白质溶液，但其效果会受到浓度、pH值以及蛋白质具体结构等多种因素的影响。

辅料与蛋白质之间的相互作用是一种复杂的现象，其机制的某些方面至今仍不完全清楚。在本研究中，我们着重探讨以下关键问题：糖类和盐类对蛋白质在界面处的行为有何影响？它们是增强还是抑制蛋白质在界面处的活性？Enbrel与IgG1在存在这些辅料时的行为存在哪些差异？辅料对蛋白质在溶液整体与界面处的相互作用有何不同影响？通过比较，我们可以更深入地了解辅料在蛋白质聚集和变性中的作用。

作为辅料，盐类会直接影响蛋白质分子间的静电相互作用。电解质的存在会屏蔽排斥力和吸引力这两种静电作用力[15][16]，这既可能增强蛋白质的稳定性，也可能促进其聚集。盐类与蛋白质相互作用的复杂性源于它们依赖于多种因素，包括离子类型、盐浓度、价态[17]、蛋白质类型、溶液pH值[18]以及其他辅料的存在[19]。目前已有大量研究利用相互作用参数（kD）和渗透第二维里系数（B22）等参数来探讨不同添加剂对蛋白质-蛋白质相互作用的影响[20]。Yadav等人[21]在低离子强度（15 mM）和高离子强度（150 mM）条件下研究了四种单克隆抗体，发现盐类会根据蛋白质的种类不同，要么增强要么减弱分子间吸引力。类似地，Saito等人[22]发现，在某种抗体中，添加NaCl并提高其浓度会在两种pH值下增强排斥力，而在另一种抗体中则会在一种pH值下降低排斥力、在另一种pH值下增强排斥力。NaCl对蛋白质溶液流变特性的影响也因化学、物理及环境因素的不同而存在显著差异，而且这些影响并不总是与kD或B22等参数相关[18][21]。

糖类则通过与盐类不同的机制，在水环境中具有稳定蛋白质的潜力。先前的研究指出，蔗糖与水或蔗糖与蛋白质之间形成的氢键在糖类存在时对稳定蛋白质起着关键作用。目前有几种机制被提出来解释蛋白质与糖类之间的相互作用，每种机制都取决于所涉及的糖类和蛋白质的具体化学性质[17][23]。蔗糖作为一种广泛用于治疗制剂中的辅料，主要通过优先水合机制来稳定蛋白质。在这一过程中，蔗糖会被排挤在蛋白质分子附近，从而使未折叠或展开状态的蛋白质的化学势高于其紧密的天然状态。这样一来，平衡就会向紧密的天然结构倾斜，从而有助于防止蛋白质的展开和聚集[10][24]。

然而，蔗糖对蛋白质稳定性和相互作用的影响并非普遍一致。例如，针对单克隆抗体的研究[25]表明，蔗糖对蛋白质聚集的影响取决于溶液的pH值，而在不同pH值下，蔗糖对蛋白质稳定性的影响则呈现相反的趋势。此外，蔗糖对不同蛋白质的影响也存在差异。与预期中能增强稳定性的结果相反，有研究发现蔗糖会增加酪蛋白钠等蛋白质的表面活性[23]。相比之下，溶菌酶和牛血清白蛋白等蛋白质在蔗糖存在的情况下，其在油-水界面处的表面活性变化很小[26]。

如前所述，先前已有研究探讨了蔗糖和NaCl对蛋白质溶液稳定性及流变特性的影响。据我们所知，目前文献中还缺乏关于蔗糖和NaCl影响治疗性蛋白质的三个重要方面的研究，而这正是我们本研究要解决的问题。首先，虽然大多数研究都集中在常见的单克隆抗体上，但融合蛋白的流变特性却几乎未被研究。其次，现有关于抗体机制行为的研究主要集中在溶液整体的性质上，而我们则关注其在机械变形条件下的界面行为。最后，对比分析融合蛋白与其对应的单克隆抗体，有助于深入了解Fab段在影响蛋白质相互作用中的作用，这一领域目前尚未被完全阐明。在我们之前的研究[27]中，我们研究了氨基酸精氨酸对三种蛋白质的影响，并指出了它们之间的差异。在此，我们进一步扩展了这一研究方法，通过比较在有无蔗糖和NaCl存在的情况下Enbrel与IgG1的界面行为及溶液整体中的蛋白质-蛋白质相互作用，以此揭示二者相互作用机制的差异。

材料与方法
Enbrel（依那西普）是从Amgen Inc.获得的市售预充式注射剂。每支注射剂含有0.98 mL溶液，其中含50 mg/mL的Enbrel、1%（w/v）的蔗糖、100 mM的氯化钠、25 mM的盐酸L-精氨酸以及25 mM的磷酸钠，溶液的pH值被调节至约6.3。NISTmAb是一种人源化IgG1κ单克隆抗体（RM 8671，批次14HB-D-001），是从美国马里兰州盖瑟斯堡的国家标准与技术研究院获得的。

结果
在溶液整体与界面区域，蛋白质-蛋白质相互作用存在显著差异[29]。在溶液整体中，蛋白质被水分子完全溶剂化，而在气-水界面处，蛋白质同时暴露于水相和空气之中，从而形成了独特的物理化学环境。因此，可以认为，无论是溶液整体还是界面区域，都会对蛋白质对辅料的反应产生重要影响。

讨论
本研究中获得的界面流变学结果表明，无论是否存在辅料，这两种蛋白质在气-水界面处都会形成随时间变化的分子间聚集体。这些聚集体的可逆性并未被直接检测，因此不在本研究的范围之内。因此，我们的讨论重点在于探讨辅料如何调节蛋白质在溶液整体及界面处的相互作用和自我聚集行为。

NaCl以其能够屏蔽静电作用而闻名……

结论
在本研究中，我们探讨了两种常见的制剂辅料——NaCl和蔗糖——如何影响蛋白质的稳定性及分子间相互作用，以及这些影响如何受蛋白质结构及相互作用发生的物理环境（溶液整体与气-水界面）的影响。为解答这一问题，我们研究了两种结构相关的治疗性蛋白质：融合蛋白Enbrel和IgG1单克隆抗体，并分析了这些辅料是如何调节它们之间相互作用的。

资金支持
本研究得到了美国新泽西州拉韦的默克公司子公司Merck Sharp & Dohme LLC以及Burroughs Wellcome Fund的支持。我们感谢Julie Liu博士及其博士生Paulina Babiak在透析操作以及紫外吸光度测量方面所提供的帮助。同时，我们也衷心感谢Yoon Yeo博士允许我们使用本研究中所用的动态光散射仪器。

作者贡献
Peyman Dastyar：撰写原始稿件、可视化处理、验证、软件应用、资源获取、项目管理、方法设计、实验开展、正式分析、数据整理、概念构建。Harsa Mitra：撰写审稿与编辑内容、软件应用、资源获取、项目管理、方法设计、数据整理。Caitlin V. Wood：撰写审稿与编辑内容、验证、监督、项目管理、资金筹集。Thomas A. Everett：方法设计、数据整理。Yu-Jiun Lin：撰写审稿内容。

利益冲突声明
所有作者均已阅读并批准了手稿的最终版本。本手稿为原创作品，此前未曾发表，也不存在同时提交其他期刊发表的情况。

致谢
本研究得到了美国新泽西州拉韦的默克公司子公司Merck Sharp & Dohme LLC以及Burroughs Wellcome Fund的支持。我们还要感谢Julie Liu博士及其博士生Paulina Babiak在透析操作及紫外吸光度测量方面给予的帮助。此外，我们也非常感激Yoon Yeo博士允许我们使用本研究中所用的动态光散射仪器。

Peyman Dastyar | Harsa Mitra | Caitlin V. Wood | Thomas A. Everett | Yu-Jiun Lin | Yu Tian | Arezoo M. Ardekani