《Journal of Hazardous Materials Advances》：Biotransformation Process of Fluoroquinolones by the Ligninolytic Enzymes of
Phanerochaete chrysosporium
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摘要：氟喹诺酮类抗生素（FQs）在环境中的日益增多，源自医院、农业、工业和家庭废水，对生态系统和公共健康构成重大威胁。在本研究中，研究人员调查了白腐真菌黄孢原毛平革菌（*Phanerochaete chrysosporium*）分泌组（secretome）的潜
摘要：氟喹诺酮类抗生素（FQs）在环境中的日益增多，源自医院、农业、工业和家庭废水，对生态系统和公共健康构成重大威胁。在本研究中，研究人员调查了白腐真菌黄孢原毛平革菌（*Phanerochaete chrysosporium*）分泌组（secretome）的潜力，该分泌组含有关键氧化酶，如木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP），用于生物转化（biotransform）这些抗生素。研究人员选择了两种氟喹诺酮类抗生素：常用于人类医学的左氧氟沙星（levofloxacin, LEV）和广泛用于兽医实践的达诺沙星（danofloxacin, DAN）。两种化合物在5至25 mg/L的浓度范围内进行了测试。为最大化效率，研究人员优化了关键理化参数，包括过氧化氢（H?O?）和硫酸锰（MnSO?）浓度、酶活性，以及螯合剂和介体的添加。根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）指南，评估了生物转化后抗生素的残留抗菌活性。木质素过氧化物酶（LiP）被确定为最有效的酶，在最佳条件下（0.3 mM H?O?、10 U/mL酶活性，且无MnSO?）实现了两种氟喹诺酮类抗生素高达100%的生物转化。此外，通过植物发芽试验证实，转化产物比母体化合物表现出显著较低的毒性。研究人员使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）鉴定了潜在的转化途径及产生的副产物。这些途径涉及脱烷基化、羟基化和氧化（仅对左氧氟沙星观察到），生成了原始氟喹诺酮类抗生素的脱烷基化、羟基化和氧化衍生物。
**论文解读：黄孢原毛平革菌分泌组对氟喹诺酮类抗生素的生物转化研究**
**研究背景与问题**
氟喹诺酮类抗生素（FQs）作为一类全合成抗菌剂，广泛应用于人类医学和兽医实践，但其在环境中的持续存在和扩散已成为重大生态与公共健康威胁。由于高达70%的给药剂量以未代谢形式排出，FQs在水体、土壤、甚至饮用水中被频繁检出，对生态系统产生毒性，并选择性地促进耐药菌群的出现与传播。尽管传统的物理化学处理方法，如过氧氧化、吸附、反渗透和膜过滤等，能够实现一定程度的去除（如反渗透对环丙沙星的去除率可达99.96%），但这些方法普遍存在能耗高、成本高、可能产生有毒副产物和废物等缺点。因此，迫切需要开发可持续、环境友好的生物修复替代方案。白腐真菌（WRF）因其独特的木质素分解酶系统（包括木质素过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶（MnP）和多功能过氧化物酶（VP））以及广泛的底物特异性，成为降解持久性有机污染物（包括多环芳烃、内分泌干扰物、合成染料、农药和药物）的杰出候选者。本研究旨在评估最具代表性的白腐真菌之一——黄孢原毛平革菌（*Phanerochaete chrysosporium*）的分泌组对两种常见FQs（人类医学用的左氧氟沙星（LEV）和兽医用的达诺沙星（DAN））的生物转化潜力，并优化工艺参数，阐明转化途径与产物毒性。
**研究内容与结论**
研究人员开展了系统性的研究，以优化*P. chrysosporium*分泌组对LEV和DAN的生物转化效率，并通过实验验证了关键酶（LiP和MnP）的作用、主要影响因素（MnSO?、H?O?、酶活性、介体、螯合剂）、产物的毒性及转化途径。研究结论表明：在优化条件下（0.3 mM H?O?、10 U/mL分泌组活性、无MnSO?），LiP是生物转化最有效的酶，可实现对两种FQs（5 mg/L）高达100%的转化；生物转化后的产物毒性显著降低；通过LC-MS/MS鉴定，转化途径主要包括脱烷基化、羟基化和氧化。该研究证实了这种基于真菌分泌组的生物方法作为传统物理化学方法的创新、环保替代方案的潜力。该论文发表在《Journal of Hazardous Materials Advances》。
**主要关键技术方法**
1. **分泌组制备与浓缩**：在鼓泡柱生物反应器中培养*P. chrysosporium*菌株I-1512，获得粗分泌组，并通过30 kDa超滤离心管进行浓缩。
2. **酶活性测定**：通过监测ABTS在420 nm处的氧化速率，测定分泌组中过氧化物酶（MnP和LiP）的总活性，并利用NaF抑制实验确认无漆酶（laccase）存在。
3. **抗菌活性评估**：采用琼脂扩散法（EUCAST指南），通过测量抑菌圈直径，计算生物转化后抗生素的残留抗菌活性百分比。
4. **毒理学评估**：利用萝卜（*Raphanus sativus*）种子发芽试验，通过计算发芽指数（GI%），评估母体抗生素及其生物转化产物的植物毒性。
5. **产物鉴定与路径分析**：采用液相色谱-电喷雾电离串联质谱法（LC-ESI-MS/MS），对生物转化后的样品进行分析，鉴定生成的副产物，并推导可能的转化途径。
**研究结果**
**3.1. 分泌组中过氧化物酶活性的测定**
通过标准测定法（0.3 mM H?O?，pH 3.0，30°C）发现，浓缩后分泌组的过氧化物酶活性显著增加，富集倍数（82-66倍）远超体积浓缩倍数（4倍），表明浓缩过程可能去除了初始抑制物。NaF抑制实验确认分泌组中无漆酶活性，主要活性来自MnP和LiP。
**3.2. 理化参数对分泌组生物转化抗生素的影响**
- **3.2.1. 硫酸锰（MnSO?）浓度的影响**：在无MnSO?条件下，两种FQs均实现了高达100%的生物转化。添加MnSO?后，在1 mM时获得最佳转化效果（5 mg/L下完全转化），但整体效率低于无MnSO?条件。这表明MnSO?可能抑制了LiP的活性。
- **3.2.2. 过氧化氢（H?O?）浓度的影响**：H?O?单独对FQs无作用。在无MnSO?条件下，0.3和0.5 mM H?O?均能实现近完全转化。即使在无外源H?O?添加的对照中，也观察到40-50%的转化，这归因于分泌组内源产生的H?O?（通过添加过氧化氢酶（catalase）实验证实，转化率下降64-85%）。0.3 mM被选为最优浓度。
- **3.2.3. 酶活性的影响**：在无MnSO?条件下，10和20 U/mL的酶活性实现了最高的生物转化效率（LEV在10和20 U/mL下完全转化；DAN在10和20 U/mL下转化率较高）。考虑到成本，10 U/mL被选为后续实验的最优酶活性。
- **3.2.4. 介体的影响**：所有测试的介体（ABTS、HBT、丁香醛、对香豆酸）均未增强生物转化，反而表现出强烈的抑制作用，推测可能是由于介体或其氧化衍生物对酶产生了负面影响。
- **3.2.5. 螯合剂的影响**：草酸钠（sodium oxalate）在50 mM浓度下增强了对LEV的生物转化，在10-50 mM浓度下增强了对DAN的生物转化。乙醛酸（glyoxylic acid）在所有测试浓度下均表现出抑制作用。
**3.3. MnSO?对LiP活性的影响**
- **3.3.1. 递增MnSO?浓度实验**：对*P. cinnabarinus*和*P. chrysosporium*的LiP活性测定结果显示，随着MnSO?浓度从0 mM增至70 mM，两种LiP的活性均呈逐渐下降趋势（平均下降约1.5倍），直接证实了Mn2?对LiP的抑制作用。
- **3.3.2. 酶与MnSO?孵育后活性测定**：将两种LiP与1 mM MnSO?在30°C孵育24小时后，*P. cinnabarinus* LiP活性下降6倍，*P. chrysosporium* LiP活性下降2倍，进一步证实了MnSO?对LiP活性的部分抑制。
**3.4. 氟喹诺酮类抗生素及其生物转化产物的植物毒性评估**
通过萝卜种子发芽试验评估植物毒性。与未经处理的抗生素对照组相比，在所有测试条件下（含MnSO?、无MnSO?、含草酸钠），经生物转化处理后的反应混合物均显著提高了种子的发芽指数（GI%）。例如，10 mg/L左氧氟沙星在无MnSO?条件下，GI%达到54.31%，远高于对照组（0%）。结果明确表明，生物转化产物的植物毒性显著低于母体化合物。
**3.5. LC-MS/MS鉴定的潜在生物转化途径及副产物**
- **左氧氟沙星（LEV）**：初始转化包括哌嗪环（piperazine moiety）的N-去甲基化，生成N-去甲基左氧氟沙星，随后通过去乙基化、脱烷基化（生成LEV1）、羟基化（生成LEV2）和氧化（生成LEV3）进一步转化。
- **达诺沙星（DAN）**：初始攻击发生在N-1环丙基和N-4甲基基团，随后通过脱甲基化、N-去环丙基化和羟基化生成DAN1、DAN2和DAN3。值得注意的是，所有DAN副产物均保留了重氮双环（diazabicyclo ring），但DAN1和DAN2失去了关键的结构基团环丙基。
**讨论与结论总结**
**讨论部分总结**：
研究表明，*P. chrysosporium*分泌组中的LiP是生物转化LEV和DAN的主要效酶，而MnP的贡献微乎其微，这归因于MnP的氧化还原电位较低，难以氧化具有较高氧化还原电位（约1 V）的FQs。MnSO?的添加会抑制LiP活性，因此最佳条件为无MnSO?。所有测试的介体均抑制了生物转化，可能因为它们或它们的氧化产物对酶产生了负面影响。草酸钠在较高浓度下作为螯合剂稳定Mn3?，对部分转化有促进作用。植物毒性测试表明，尽管生物转化显著降低了毒性，但残留的H?O?或中间产物可能仍对幼苗生长有轻微抑制。LC-MS/MS分析揭示了转化途径主要涉及哌嗪环或重氮双环的脱烷基化、羟基化和氧化，这与文献报道一致。哌嗪环的断裂或移除通常导致抗菌活性显著降低，而达诺沙星的副产物DAN3因保留了环丙基和重氮双环，可能保留较高活性，这与生物活性测定结果一致。研究也指出，实验条件（酸性pH、高浓度抗生素）与真实环境基质存在差异，后续需在更接近实际的环境条件下验证该系统。
**研究结论（翻译）**：
在本研究中，研究人员证明了*P. chrysosporium*的分泌组能够在5至25 mg/L的浓度范围内生物转化左氧氟沙星和达诺沙星，最佳条件为0.3 mM H?O?和10 U/mL的分泌组活性。研究人员还观察到，Mn2?离子可能对LiP活性有抑制作用。LiP被确定为生物转化最有效的酶，产生的副产物毒性低于原始抗生素。对转化产物的LC-MS/MS分析将其鉴定为脱烷基化、羟基化和氧化的衍生物。这些结果证实了这种生物方法作为传统物理化学方法（通常成本高昂且产生有毒副产物）的一种潜在创新且环境友好的替代方案的有效性。
