《Journal of Hazardous Materials Advances》：Wastewater and colloidal extracts of wastewater-irrigated soils select for resistant
Acinetobacter baylyi beyond what measured antibiotic concentrations predict
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大量研究表明，废水灌溉后土壤中抗生素耐药菌（antibiotic-resistant bacteria, ARBs）或抗生素耐药基因（antibiotic-resistance genes, ARGs）的丰度增加。然而，尚不清楚这种增加是由于灌溉水中药物残留的
大量研究表明，废水灌溉后土壤中抗生素耐药菌（antibiotic-resistant bacteria, ARBs）或抗生素耐药基因（antibiotic-resistance genes, ARGs）的丰度增加。然而，尚不清楚这种增加是由于灌溉水中药物残留的选择效应，还是由于废水持续引入ARBs和ARGs所致。此外，目前尚不清楚抗生素与天然胶体（1-1000 nm）的结合如何影响其生物效应，与真正溶解物质（<1 nm）相比。研究人员在废水以及废水灌溉土壤的胶体和真正溶解提取物中，对耐药和敏感的Acinetobacter baylyi BD413菌株进行了竞争实验。尽管六种目标抗生素的浓度远低于所测菌株的最小选择浓度（minimum selective concentrations, MSCs），但研究人员证明，耐药菌株在废水和胶体提取物中受到青睐。相比之下，真正溶解部分表现出较弱且更可变的选择效应。非靶向分析揭示了提取物中存在82种物质，包括其他抗生素、杀虫剂和不同的非抗生素药物，这些可能影响耐药A. baylyi BD413菌株的选择。研究人员的发现表明，废水和废水灌溉土壤中抗生素耐药性的选择不能仅用抗生素浓度解释，也可能是由共存污染物的复杂混合物的效应引起的，尤其是那些与胶体颗粒相关的污染物。
**论文解读：废水灌溉土壤中抗生素耐药性的选择性驱动因素——胶体结合污染物与复杂混合物的作用**
**研究背景**
抗生素耐药性（antibiotic resistance, AR）是当代公共卫生的重大威胁。尽管临床和畜牧业中的抗生素使用是主要驱动因素，但环境作为耐药菌（antibiotic-resistant bacteria, ARBs）和耐药基因（antibiotic resistance genes, ARGs）的储库日益受到关注。废水灌溉，尤其是未经处理的废水灌溉，在干旱和半干旱地区广泛用于农业，以缓解水资源短缺并循环养分。然而，废水中的抗生素残留、消毒剂、重金属等污染物会进入土壤，并可能促进ARBs和ARGs的传播。已有研究表明，长期废水灌溉导致土壤中抗生素累积，但尚不清楚这种增加是由于废水持续引入抗性菌/基因，还是由于残留抗生素的选择压力。此外，天然胶体（1-1000 nm）在土壤和水中广泛存在，其高比表面积和反应性使其成为抗生素等污染物的强结合相。但胶体结合对抗生素生物有效性和选择效应的影响尚不明确。因此，本研究旨在揭示胶体结合在废水和废水灌溉土壤中抗生素耐药性选择中的作用，并评估从使用未经处理废水向处理废水转变的潜在后果。
**研究内容与结论**
研究人员以墨西哥梅斯基塔尔山谷（Mezquital Valley）为研究区域，该地区拥有超过100年使用未经处理废水灌溉的历史。研究人员采集了三种主要土壤类型（Leptosol、Phaeozem、Vertisol）的样本，以及阿托托尼科污水处理厂（Atotonilco WWTP）的进水和出水。通过竞争实验，使用荧光标记的耐药和敏感Acinetobacter baylyi BD413菌株，在废水、土壤胶体提取物和真正溶解提取物中评估选择效应。研究得出以下结论：废水及土壤胶体提取物（即使抗生素浓度远低于最小选择浓度（MSC））能够显著选择耐药菌株；胶体结合污染物仍具有生物有效性，且选择效应强于真正溶解部分；非靶向分析揭示了82种共存污染物，包括其他抗生素、非抗生素药物（NADs）和农药，这些物质可能共同驱动耐药性选择。本研究发表在《Journal of Hazardous Materials Advances》。
**关键技术与方法**
1. **竞争实验**：使用荧光标记的A. baylyi BD413菌株（耐药突变体mCherry 652和mCherry 777，以及携带pHHV216质粒的菌株）与敏感菌株（GFP）按1:1比例接种，在废水和土壤提取物中培养后计数菌落形成单位（CFU），计算耐药菌比例。
2. **胶体与真正溶解提取物制备**：采用水可提取胶体法，通过超速离心（235,000 × g，26小时）分离土壤提取物中的胶体相（<1000 nm）和真正溶解相（<1 nm）。
3. **抗生素浓度测定**：使用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）测定六种目标抗生素（磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、红霉素、克林霉素、环丙沙星、阿奇霉素）在提取物中的浓度。
4. **非靶向分析**：对六种胶体提取物进行嫌疑筛查，数据库包含约3500种物质，以鉴定其他潜在选择物质。
5. **重建浓度实验**：将实测抗生素浓度在1:10稀释的Müller-Hinton肉汤（MHB）中重建，进行竞争实验以验证单独抗生素的作用。
**样本队列来源**：土壤样本来自墨西哥梅斯基塔尔山谷的三个土壤类型，每个类型四个田间重复，共12个复合样本；废水样本来自阿托托尼科污水处理厂的进水和出水。
**研究结果**
1. **最小抑制浓度和最小选择浓度**
通过测定不同A. baylyi BD413菌株对六种抗生素的MIC和MSC，发现耐药菌株mCherry 652和mCherry 777的MSC远低于相应敏感菌株的MIC，且MSC/MIC比值低至0.02-0.45，表明低浓度抗生素即可产生选择压力。
2. **废水有利于耐药突变体生长**
在未加标和加标的废水（进水和出水）中，mCherry 652菌株在竞争实验中显著占优，占比高达80%；而mCherry 777和携带pHHV216质粒的菌株仅在加标样品中占优。重建浓度实验显示，仅使用六种目标抗生素无法重现废水中的选择效应，表明其他物质参与了选择。
3. **土壤提取物中抗生素浓度**
通过UPLC-MS/MS测定，胶体相中抗生素浓度普遍高于真正溶解相。所有提取物中抗生素浓度均远低于相应MSC值，最大浓度仅为MSC的百分之几。
4. **胶体土壤提取物产生强选择效应**
在92%的胶体提取物中，耐药菌mCherry 652占比超过50%，在53%的提取物中超过65%。相比之下，真正溶解提取物中仅58%超过50%。加标水平是唯一显著影响选择的因素（p<0.0005），但未加标样品的选择效应反而强于加标样品。土壤类型、废水类型和培养时间无显著影响。重建浓度实验再次表明，六种目标抗生素无法解释选择效应。
5. **非靶向分析揭示更多抗菌物质**
在六种胶体提取物中鉴定出57种可疑物质，包括8种仅存在于强选择提取物中的化合物（如氟苯酰胺、全氟辛酸、噻虫啉等）。所有提取物中均检出克拉霉素，而萘啶酸仅在强选择样品中全部检出。此外，还检出多种非抗生素药物（如卡马西平）和农药（如嘧菌酯、多菌灵），这些物质已知可促进耐药性选择或水平基因转移（HGT）。
**讨论与结论**
**讨论总结**：
研究人员发现，废水及土壤胶体提取物中耐药菌的选择效应不能仅由六种目标抗生素解释，因为其浓度远低于MSC，且重建实验未产生选择。相反，非靶向分析揭示了多种共存污染物，包括其他抗生素（如克拉霉素、萘啶酸）、非抗生素药物（如卡马西平、抗抑郁药）和农药，这些物质可能通过协同作用、交叉耐药或激活耐药机制（如SOS反应、外排泵表达）共同驱动耐药性选择。胶体相中污染物浓度较高，且胶体作为微生物的碳源和营养热点可能增强其生物有效性。此外，废水处理（阿托托尼科WWTP）未显著降低选择效应，因为其处理工艺旨在保留养分，导致抗生素和耐药菌持续存在。土壤类型和培养时间未显著影响选择，可能是由于田间土壤性质的高度变异性掩盖了差异。然而，加标样品的弱选择效应可能与加标抗生素抑制敏感微生物后，促进降解菌（如假单胞菌属）生长有关，从而减少了选择压力。
**结论翻译**：
敏感和耐药A. baylyi BD413菌株之间的竞争相互作用提供了对废水灌溉如何塑造农业土壤中抗生素耐药性选择压力的综合性评估。竞争实验结果表明，无论废水处理与否，废水样品和废水灌溉土壤的胶体提取物均强烈选择耐药A. baylyi BD413 mCherry 652。因此，研究人员的假设——“用WWTP出水灌溉时，过去用未经处理废水灌溉积累的土壤中抗生素的溶解会增加ARBs的选择”——未得到支持。相反，促进ARBs选择的环境压力似乎保持不变，与废水处理无关。而废水处理的效果对于该处理工艺的设计而言较低，因为它旨在保持出水中的养分浓度尽可能高。出乎意料的是，在所有测试的土壤和培养条件下，胶体提取物中均观察到对ARBs的强选择。因此，研究人员拒绝了“与土壤胶体结合的抗生素比真正溶解相中的抗生素效果更弱”的假设。由于观察到对抗生素耐药性的选择效应，研究人员得出结论：胶体结合的抗生素以及很可能其他药物仍对测试细菌具有生物有效性。因此，未来对废水和废水灌溉土壤的研究应纳入胶体部分，并且不应将胶体结合的药物视为失活。
长期使用未经处理废水灌溉的效应在梅斯基塔尔山谷已得到充分研究。研究人员的结果表明，阿托托尼科WWTP未能将出水中的抗生素和其他药物残留水平降低到不再选择ARBs的程度。因此，研究人员得出结论：用该出水灌溉对灌溉土壤和作物中ARBs和ARGs的持续选择和传播具有高风险。由于WWTP的出水也被用于灌溉人类生食的蔬菜，耐药菌更快传播的风险尤其高。
在此，研究人员分离了水可提取胶体作为操作定义的池，其局限性在于分散作用可能使胶体表面数量高于田间条件，从而也增加了其他胶体结合污染物的浓度，但同时增加了污染物固定加标抗生素的潜在能力。尽管如此，在全部实验中，研究人员的明确结果表明，仅基于抗生素浓度的解释不足以说明所观察到的选择模式。可测量的抗生素浓度远低于MSC，且在对照实验中未导致耐药菌株的选择。这表明直接抗生素选择不太可能是这些系统中耐药性进化的主要驱动因素。非靶向筛查证实了多种其他污染物的存在，包括与ARBs和ARGs选择相关的其他抗生素、农药和NADs。废水灌溉环境中的ARBs和ARGs可能不仅受抗生素影响，还受更广泛的污染物混合物影响。目前主要基于单一化合物抗生素阈值的环境风险评估框架可能因此大大低估了实际农业系统中耐药性选择的复杂性和强度。
