《Journal of Hazardous Materials Advances》：Network toxicology integrated with single-cell RNA sequencing reveals ROS-related targets of paraquat in pulmonary fibrosis
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摘要目的本研究通过多组学和单细胞方法，探讨了驱动从急性损伤向百草枯（PQ）诱导的肺纤维化（PF）转变的细胞异质性和分子靶点。方法研究人员从CTD数据库中检索了百草枯（PQ）的化学-基因相互作用以及肺纤维化（PF）的基因-疾病关联，并进行了标准化，将PF基因限制
摘要目的本研究通过多组学和单细胞方法，探讨了驱动从急性损伤向百草枯（PQ）诱导的肺纤维化（PF）转变的细胞异质性和分子靶点。方法研究人员从CTD数据库中检索了百草枯（PQ）的化学-基因相互作用以及肺纤维化（PF）的基因-疾病关联，并进行了标准化，将PF基因限制为CTD“直接证据”记录以提高置信度。所得的PQ-PF候选基因被映射到STRING数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）拓扑分析，并映射到百草枯损伤的人肺单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集（GSE231647）进行细胞类型定位和通信推断（Seurat v5.0.1; cellchat version 2.1）。研究人员采用了一种ROS-抗氧化剂-转运蛋白优先排序方案来提名氧化还原相关靶点，随后进行了盲分子对接（CB-Dock2）以评估结构合理性。结果直接证据筛选得到122个PF基因，与4,849个PQ靶点取交集后，产生了一个由82个基因组成的PQ-PF连接点。PPI分析识别出炎症-纤维化枢纽（IL1B, TNF, IL6, TGFB1, STAT3, FN1, 和 MMP9），并且在更高的STRING置信度阈值（≥0.7）下仍保持稳健。单细胞定位将ROS相关候选靶点定位于巨噬细胞、气道上皮细胞和肌成纤维细胞；CellChat分析突出了通过细胞外基质（ECM）重塑和SPP1/MIF通路介导的显著的巨噬细胞→成纤维细胞信号传导。分子对接支持PQ与抗氧化/应激反应蛋白（GPX3, SOD1, 和 HMOX1; ?6.67至?5.93 kcal/mol）之间存在结构上合理的微摩尔级相互作用。结论总之，这个从网络到单细胞再到结构的分析框架支持了PQ诱导的肺纤维化中一个以氧化应激为中心、多靶点的机制，并提名了一个以GPX3/SOD1为中心的抗氧化模块和可诱导的HMOX1应激反应轴，以及上游的炎症-纤维化枢纽，作为有待进一步实验验证的候选干预节点。对接结果与结构上合理的低亲和力PQ结合相一致，同时与体内间接的氧化还原介导的调节兼容。环境意义百草枯（PQ）是一种广泛使用的除草剂，以其高毒性和诱导肺纤维化的作用而闻名，但驱动其从急性损伤向慢性纤维化转变的谱系特异性分子靶点和机制尚未完全阐明。本研究确定了一个以GPX3/SOD1为中心的氧化还原模块和一个与HMOX1相关的应激反应轴是PQ诱导的肺损伤的关键决定因素，并为其生化隔离提出了一个多靶点、低亲和力的相互作用模型。这些发现强调了严格监管环境PQ暴露的紧迫性，并为开发精准的抗氧化干预措施以减轻毒素诱导的间质性肺疾病的健康负担提供了科学依据。
**论文解读：网络毒理学与单细胞转录组学整合揭示百草枯诱导肺纤维化的活性氧相关靶点**
**研究背景、问题与目的**
百草枯（PQ）是一种广泛使用的非选择性联吡啶类除草剂，因其高毒性和导致肺纤维化（PF）的独特能力而成为全球公共卫生重大挑战。其环境持久性强，可通过多种途径导致人群暴露，但缺乏特效解毒剂，导致急性中毒死亡率极高。尽管氧化应激、免疫炎症反应和上皮-间充质转化（EMT）被认为是PQ诱导PF的关键因素，但驱动急性损伤向慢性纤维化重塑转变的分子靶蛋白和谱系特异性调控网络仍不清楚。特别是，受体酪氨酸激酶（RTK）信号通路和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）在PQ诱导的氧化损伤与纤维化网络中的具体作用和整合机制尚未被系统阐明。为解决这一知识空白，研究人员假设PQ诱导的肺纤维化并非由单一线性毒性通路驱动，而是由一个以氧化应激为中心的多细胞网络驱动，其中氧化还原防御破坏、巨噬细胞/上皮细胞/成纤维细胞通讯和细胞外基质（ECM）重塑共同促进纤维化的持续进展。本研究旨在通过整合系统的网络毒理学、高分辨率单细胞转录组学（scRNA-seq）和计算机结构分析，阐明共享的PQ-PF靶点，优先筛选ROS相关的解毒枢纽，定义其细胞类型特异性表达和通讯模式，并评估PQ与靶点相互作用的结构合理性，为毒素诱导的间质性肺疾病提供候选治疗靶点。该论文发表在《Journal of Hazardous Materials Advances》。
**主要关键技术方法**
1. **数据整合与网络构建**：从比较毒物基因组学数据库（CTD）获取PQ的化学-基因相互作用数据和PF的基因-疾病关联数据，经标准化和筛选后，取交集得到82个PQ-PF共享候选基因，并在STRING数据库（version 12.0）中构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。
2. **单细胞转录组分析**：利用百草枯损伤的人肺scRNA-seq数据集（GSE231647，来自双肺移植样本），使用Seurat v5.0.1进行质量控制、降维、聚类和细胞类型注释。使用CellChat（version 2.1）推断细胞间通讯网络。
3. **ROS相关靶点优先排序与分子对接**：构建一个包含150个基因的ROS相关基因库，与PQ靶点库取交集得到31个PQ-ROS基因。对这些基因进行多指标复合评分（整合网络中心性、单细胞表达丰度和阳性细胞比例），并通过CB-Dock2服务器进行盲分子对接，以评估PQ与候选靶点蛋白（如GPX3, SOD1, HMOX1）的结合亲和力。
**研究结果**
1. **Identification of the PQ-PF Pathogenic Interactome and Topology-Based Hub Selection**：通过整合CTD数据，研究人员获得了82个PQ-PF共享候选基因，其PPI网络包含73个节点和2,058条边。拓扑分析识别出炎症-纤维化核心调控因子，包括IL1B、TNF、IL6、TGFB1、STAT3、CXCL8、CCL2、FN1、HIF1A和MMP9。这些枢纽在更严格的STRING置信度阈值下仍保持稳定，证实了其作为关键调控节点的可靠性。
2. **Functional Landscape and Mechanistic Deciphering of the PQ–PF Interactome**：对82个共享基因进行功能富集分析，结果显示这些基因显著富集于上皮细胞增殖与修复、炎症反应调控、平滑肌细胞增殖、凋亡信号调控和血管生成等生物学过程（BP）。KEGG通路分析进一步揭示了IL-17信号、TNF信号、细胞因子-细胞因子受体相互作用和MAPK信号等炎症信号网络是PQ-PF基因集的主要特征，同时富集了AGE-RAGE信号和ECM相关通路，支持了氧化应激-炎症-重塑的纤维化进展轴。
3. **Single-Cell Transcriptomic Atlas and Cell-Type-Specific Target Topography**：通过对GSE231647数据集的单细胞分析，研究人员构建了高分辨率的人肺细胞图谱。结果显示，优先筛选的ROS相关对接靶点（GPX3, HMOX1, SOD1）在巨噬细胞、气道上皮细胞和肌成纤维细胞等关键效应细胞中表达。特别是，HMOX1表现出更强的应激反应性和细胞类型偏向性表达模式。细胞通讯分析（CellChat）显示，在PQ损伤的肺微环境中，巨噬细胞与成纤维细胞之间存在密集的通讯，其中SPP1、MHC-II和FN1通路在巨噬细胞→成纤维细胞信号传导中占主导地位，为巨噬细胞驱动的炎症/氧化应激与下游成纤维细胞激活之间的机械联系提供了证据。
4. **Structure-Based Validation of Paraquat-Target Interactions and Energetic Profiling**：盲分子对接结果显示，PQ与几个ROS相关靶点存在可测量的结合亲和力。其中，与GPX3（结合能-6.67 kcal/mol，抑制常数Ki≈13.0 μM）和SOD1（-6.58 kcal/mol，Ki≈14.91 μM）的结合能最为有利。HMOX1也表现出稳定的结合构象（-5.93 kcal/mol，Ki≈44.77 μM）。这些相互作用主要由弱非共价键驱动，支持PQ可能通过弱的多靶点相互作用影响抗氧化酶活性的假设。
**总结与讨论**
本研究通过整合证据加权的毒物基因组学、相互作用组拓扑学、细胞类型分辨率的单细胞转录组学以及基于结构的分子对接，提供了一个机制锚定的视角，阐明了PQ暴露如何从急性氧化损伤发展为持续的纤维化重塑。讨论部分强调了以下几点：
1. **多细胞网络模型**：PQ毒性不仅仅是ROS负担的下游结果，而是源于一个抗氧化防御、免疫感知和基质修复程序相互强化的耦合网络。持续的氧化应激放大促纤维化信号，而纤维化重塑和免疫激活进一步重塑氧化还原微环境，形成自我维持的损伤-修复失衡。
2. **关键的ROS相关靶点**：研究重点讨论了优先筛选出的三个靶点：GPX3（细胞外谷胱甘肽过氧化物酶，作为第一道酶促屏障）、SOD1（胞质Cu/Zn-超氧化物歧化酶，在清除超氧阴离子的同时可能产生“双刃剑”效应）和HMOX1（血红素加氧酶-1，可诱导的抗氧化防御蛋白）。这些靶点构成一个跨越细胞外和细胞内抗氧化防御的协同三元组。
3. **治疗策略的互补性**：研究人员提出，靶向上游炎症-纤维化调控因子（如TNF、IL-6、TGFB1）可能提供更广泛的抗纤维化覆盖，而针对GPX3、SOD1和HMOX1的抗氧化干预则可能更选择性地缓冲PQ毒性中特有的氧化应激成分。这两种策略应被视为潜在的互补而非互斥。
4. **研究局限与未来方向**：本研究存在数据库依赖、样本量有限、缺乏独立湿实验验证等局限性。未来研究需要通过酶活性测定、基因扰动、结合实验（如热位移分析、表面等离子体共振）和分子动力学模拟，对GPX3-SOD1-HMOX1模块进行实验验证。
**结论翻译**：总之，本研究提供了一个系统的多尺度框架，整合了毒物基因组学、网络拓扑学和单细胞转录组学，用以识别百草枯诱导的肺纤维化背后的潜在分子靶点。研究人员强调了GPX3、SOD1和HMOX1作为优先的ROS相关靶点，它们具有支持性的网络和表达证据以及可测量的对接亲和力，为未来的机制验证和治疗探索提供了可检验的假设。
