《Journal of Hazardous Materials》：Ferrate(VI) oxidation drives adaptation toward a putative VBNC-like state in
Escherichia coli associated with oxidative stress, metabolic repression, and membrane remodeling
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摘要六价铁作为一种具有前景的环保氧化剂，被用于高级水处理中，然而它与细菌休眠状态之间的相互作用及其对水质安全的影响目前仍不甚清楚。本研究探讨了在盐水和地表水环境中，六价铁作用下大肠杆菌进入存活但不可培养状态的情况及其影响。六价铁能够迅速使大肠杆菌失去可培养性，但同时也会产生一群膜
摘要
六价铁作为一种具有前景的环保氧化剂，被用于高级水处理中，然而它与细菌休眠状态之间的相互作用及其对水质安全的影响目前仍不甚清楚。本研究探讨了在盐水和地表水环境中，六价铁作用下大肠杆菌进入存活但不可培养状态的情况及其影响。六价铁能够迅速使大肠杆菌失去可培养性，但同时也会产生一群膜结构完好却无法培养的细菌，这类细菌可通过氧化应激反应、代谢抑制以及膜结构重塑等生理适应机制来存活。这种适应策略不仅有助于细菌持续存在，还能使其对环境压力和抗生素产生较强的抗性。更重要的是，当这些细菌重新活化后，它们能够部分恢复与上皮细胞的相互作用能力，包括在Caco-2肠上皮细胞中的黏附、侵袭以及细胞毒性反应等。这些发现表明，六价铁的氧化作用可能会无意中筛选出那些具有较强存活能力的细菌，这类细菌虽难以被常规检测到，但仍保留与宿主细胞相互作用的能力。这种难以检测与仍具生理活性之间的差异，给现有的以培养法为基础的水质标准及处理策略带来了挑战。因此，本研究强调有必要将分子水平上的存活性评估纳入水质监测中，以便有效应对大型水体中那些可重新活化的不可培养细菌所带来的潜在风险。
引言
在水生环境中，存活但不可培养的细菌对全球公共卫生构成了重大威胁，尤其是在饮用水和废水处理系统中。传统的监测方法依赖于异养菌平板计数，但这些基于培养的方法无法检测到那些能够逃避常规检测的存活但不可培养的细菌[1]、[2]。这类细菌采用了一种独特的休眠生存策略，其特点是膜结构保持完整，但整体转录和代谢活动显著降低[3]。在水处理过程中，人为因素和环境压力常常会引发细菌的此类生理变化，比如消毒带来的氧化应激[4]、渗透压冲击[5]以及抗生素残留[6]。尽管这类隐蔽的病原体无法被培养，但它们往往仍具有致病性和耐受性，成为潜在的感染源[7]。在诸如供水网络这样的有利条件下，这些细菌可以重新恢复致病性，从而增加水传播疾病的风险[8]；而在人体肠道内重新活化则进一步提升了胃肠道感染的威胁[9]。这种难以检测与仍具致病性之间的矛盾，给现有的安全防护措施带来了巨大挑战，也暴露出水生系统中的潜在公共卫生风险。
在各类水传播病原体中，诸如O157:H7血清型的大肠杆菌是导致食物和水污染相关感染的主要元凶，这类感染可引发出血性结肠炎、肠炎以及溶血性尿毒症综合征[10]、[11]。美国疾病控制与预防中心在2024年的数据显示，每年约有97,000例大肠杆菌感染病例，其中约30人因此死亡[12]，而旅行者腹泻在很大程度上就是由大肠杆菌引起的，占比高达70–95%，这充分体现了该问题对全球人员流动造成的影响[13]。存活但不可培养的大肠杆菌仍具有重新活化的潜力，能够侵入宿主体内并造成危害[14]。2011年德国曾发生过一起疫情，当时自来水中的铜元素促使大肠杆菌进入存活但不可培养状态，进而引发了血性腹泻和溶血性尿毒症综合征[15]。为控制这类风险，人们通常使用非致病性大肠杆菌作为卫生指标，以此评估水处理的成效[16]。然而，存活但不可培养状态的存在让这些指标的可靠性受到了质疑，因为那些看似已被灭活的细菌实际上可能掩盖了细菌污染的持续存在，这意味着致病性大肠杆菌也同样有可能逃避检测。
六价铁（FeVIO?2?；Fe(VI)）是一种多功能且环保的氧化剂，可用于水处理，能够同时实现氧化、消毒以及去除污染物和微生物的作用[17]。它在酸性介质中的氧化还原电位高达+2.2伏，在碱性介质中则为+0.7伏，而且不会产生有害的消毒副产物，因此越来越被视作高级氧化处理过程中替代氯气的理想选择[18]、[19]。不过，人们通常认为六价铁是一种理想的消毒剂，却忽视了一个重要的生物学问题，即细菌面对强烈化学氧化时的反应机制。虽然六价铁的致命效应已有大量研究记载[20]、[21]、[22]，但现有的监测方法主要依赖培养技术，从而忽略了氧化应激可能引发的细菌休眠现象。具体而言，如果六价铁处理只是让大肠杆菌进入存活但不可培养状态，而非彻底将其灭活（导致细胞裂解），那么人们所认为的消毒效果实际上会被高估。因此，填补关于六价铁诱导细菌进入存活但不可培养状态及其重新活化机制的知识空白，对于准确评估这种新兴氧化剂的安全性至关重要。
为弥补现有研究的不足，本研究旨在：（一）在实验室可控条件下，研究0.85% NaCl溶液以及经过过滤和高压灭菌的地表水物理化学环境中，六价铁诱导大肠杆菌进入存活但不可培养状态的动力学过程；（二）比较存活但不可培养状态的大肠杆菌与可培养大肠杆菌在生理和生化特性上的差异，从而明确六价铁作用下细菌维持存活但不可培养状态的具体机制；（三）在特定的实验室条件下研究六价铁诱导的存活但不可培养状态大肠杆菌的重新活化潜力，包括重新活化后的形态特征以及应激反应特性；（四）检测可培养大肠杆菌、存活但不可培养状态的大肠杆菌以及重新活化后的大肠杆菌与Caco-2肠上皮细胞之间的相互作用，重点分析细胞屏障功能以及炎症反应情况。总体而言，这些研究结果有助于深入理解六价铁氧化作用与细菌休眠状态之间的相互作用，为制定基于风险的消毒策略提供依据，同时也揭示了那些可以重新活化的水传播细菌所构成的潜在致病威胁。
章节节选
试剂与水样准备
六价铁钾盐[Fe(VI)，CAS编号：39469-86-8]购自北京索拉生物科技有限公司。LB琼脂和LB培养基则来自北京卢桥科技有限公司。其他所有生化试剂均为分析级产品。
研究用水取自中国陕西省宝鸡市的石头河水库，作为可控的地表水物理化学实验环境。这些水样首先通过0.45微米的纤维素滤膜过滤，随后进行高压灭菌处理，并对其各项理化性质进行了检测。
六价铁诱导指示性大肠杆菌进入存活但不可培养状态
将指示性大肠杆菌（CMCC 44102）暴露在浓度为2.5至30.0毫克/升的六价铁所构成的0.85%（质量/体积比）NaCl溶液或地表水中，结果显示，随着六价铁浓度的升高，大肠杆菌的可培养性逐渐下降，而那些未被PI染色的、膜结构完好的细胞数量则基本保持稳定（见图1B、C）。在NaCl溶液中，当六价铁浓度分别为10.0、15.0、20.0和30.0毫克/升时，大肠杆菌的可培养性分别在120分钟、60分钟、45分钟和15分钟内降至无法检测的水平，即1个菌落形成单位/毫升；相反，较低浓度的六价铁则不会导致如此快速的不可培养性变化。
讨论
存活但不可培养的细菌状态代表了细菌的一种适应性休眠机制，它使得细菌能够在亚致死性的氧化应激环境下存活，因为这种状态下细菌的可培养性与实际存活能力并不完全同步，而这些难以被检测到的细菌仍然具有致病性[39]。在本研究中，浓度为2.5–30.0毫克/升的六价铁能够在15–120分钟内促使大肠杆菌在NaCl溶液或地表水中进入存活但不可培养状态，此时细菌的可培养性降至0个菌落形成单位/毫升，但其存活细胞数量仍可维持在106–107个细胞/毫升的水平。
环境意义
六价铁被越来越多地应用于水处理领域，以降低水中的微生物危害，但在消毒效果评估中，人们往往忽视了它对细菌休眠状态的影响。在盐水和水库水环境中，六价铁能够使大肠杆菌从可培养的指示菌转变为膜结构完好但无法培养的存活状态。在氧化应激、代谢抑制以及膜结构硬化等因素的共同作用下，这类细菌的生存能力得到了提升。
CRediT作者贡献说明
杨辉：撰写原始稿件、开展实验研究、整理数据、构建研究概念。 史超：参与稿件审阅与编辑工作、负责项目管理工作以及资金申请。 王欣：承担研究指导工作、进行正式数据分析。 段梦华：负责软件应用工作、参与正式数据分析。 游逸熙：负责数据可视化处理、参与正式数据分析。 徐伟鹏：设计研究方法、参与正式数据分析。 杨宝伟：提供研究资源、参与方法设计工作。 单中华：负责数据可视化处理、参与正式数据分析。 张春玲：承担研究指导工作、提供研究资源。 王书奇：负责研究结果验证工作、参与软件应用。
利益冲突声明
所有作者均声明，他们不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了深圳市自然科学基金（项目编号：JCYJ20230807111500001和JCYJ20240813151818024）以及国家自然科学基金（项目编号：32272445）的支持。
Hui Yang|Weipeng Xu|Yixi You|Menghua Duan|Shuqi Wang|Chunling Zhang|Zhongguo Shan|Baowei Yang|Xin Wang|Chao Shi
中国广东省深圳市518057，西北农林科技大学深圳研究院
