用于高效生物降解的酯键预活化：通过改良细菌实现PET的自强化降解策略

《Journal of Hazardous Materials》：Ester Bond Pre-Activation for High-Efficiency Biodegradation: A Self-Reinforcing Degradation Strategy for PET via an Evolved Bacterium

　　

摘要

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种危险的环境污染物，既会导致塑料污染也会造成微塑料污染。由于其酯键的化学稳定性极高，尤其是在碱性工业废水（pH 9–11）中，大多数已知生物催化剂都无法发挥作用，从而严重限制了其生物降解速度。为了解决这一问题，研究人员通过进化工程手段构建了一种适用于碱性环境的整体细胞生物催化剂。通过UV-LiCl诱变和适应性实验室进化，成功培育出一种适应碱性环境的Comamonas testosteroni菌株F6，该菌株在pH 10且以PET作为唯一碳源的条件下仍能良好生长。与野生型相比，菌株F6在3天内使PET的重量损失从2.4%提升至6.1%，并且能更快地释放对苯二甲酸。这一改善得益于一种协同作用机制：碱性条件会化学预活化酯键，而释放出的单体则能为微生物生长和酶分泌提供能量，进而形成自我强化的降解循环。这种反馈驱动的过程导致纤维表面严重侵蚀，纤维直径从20.2微米降至18.1微米。该系统在温和的pH 10和37摄氏度条件下运行，具有自我调节功能，能够部分中和碱性，这与需要高pH值和高温的化学水解方法有所不同。这项研究为利用底物预活化和进化生物催化技术处理含有PET的碱性工业废水提供了理论依据。

引言

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种由化石基原料合成的半结晶热塑性聚酯。由于其出色的机械性能、化学稳定性和透明度，它被广泛用于包装、纺织以及工程塑料领域[1]。目前，全球PET的年产量超过8200万吨，但其中只有不到20%被回收利用[2]、[3]、[4]、[5]。这就导致了大量PET在垃圾填埋场和自然环境中堆积，单个PET制品甚至可能持续存在数百年。尤其是PET纤维，在纺织加工废水中的碎片会持续存在于环境中，对生物体和人类健康构成进一步威胁[6]、[7]。传统的PET废物处理方法，如填埋、焚烧、醇解和胺化等，通常需要消耗大量化学品和土地资源，还可能引发二次污染[8]。

PET的生物降解是指微生物或酶将PET分解为无害的单体。与传统物理和化学回收方法相比，生物降解因其温和的反应条件、较低的能源需求以及较小的环境影响，成为处理PET废物的更可持续策略[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。PET的降解主要由能够水解其酯键的微生物酶介导，如图1所示[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。然而，这些酯键在接近中性的条件下具有较高的化学稳定性，这限制了酶促水解的速率。虽然热处理或机械预处理等方法可以通过降低聚合物的结晶度并提高酶的活性来促进生物降解，但这些方法往往需要消耗大量能源[20]。碱性环境则提供了一种不同的化学优势：氢氧根离子（OH?）可作为强亲核试剂，攻击酯键的羰基碳，削弱化学键并使其易于断裂[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]。利用这种碱性界面激活作用，可以显著提升后续的生物催化效率。在涉及PET的工业生产过程中，会产生大量碱性废水（pH 9–11），包括用于PET纺织品碱减量处理的废水以及使用碱性催化剂进行PET化学回收的废水[21]、[23]。这些废水构成了大量尚未得到有效处理的含PET的碱性废弃物，亟需有效的治理方案。然而，目前存在一个关键瓶颈：大多数已知的能够降解PET的天然微生物在中性pH条件下才能发挥最佳活性，而在碱性条件下其生长和酶活性都会受到严重抑制。这种有益的碱性环境与微生物耐受性之间的矛盾，形成了巨大的技术差距。

适应性实验室进化（ALE）是一种新兴策略，通过模拟自然界中的变异和选择过程，帮助筛选出具有优异特性的微生物菌株[29]、[30]、[31]、[32]。该技术已在提高微生物的代谢产物产量和生理耐受性方面取得了显著进展[33]、[34]。最近，适应性实验室进化已被成功应用于帮助微生物降解那些原本难以降解的聚合物。例如，在以未经处理的原始高密度聚乙烯作为唯一碳源的严格选择压力下进行长期适应性实验室进化，最终获得了Pandoraea sp. B8菌株，该菌株能够表现出可重复的表面降解现象，并且有可测量的二氧化碳释放量[35]。进化工程策略正逐渐成为提升微生物生物催化能力的强大工具。除了用于聚合物降解外，适应性实验室进化还被用来提高微生物对高温、高盐度以及酸性pH等环境压力的耐受性[30]、[36]、[37]。与那些使用基因工程菌株的研究不同，本研究采用的是通过UV–LiCl诱变结合适应性实验室进化获得的天然非重组细菌。由于这种策略不涉及外源基因的引入，因此避免了与重组DNA技术相关的监管难题，提升了其在现场处理含有PET的碱性工业废水方面的实际应用价值。这是首次将进化工程应用于在同一天然菌株中同时培育出碱性耐受性和PET降解能力，这样的联合效果此前尚未有相关报道。

本研究通过系统的进化工程策略，培育并表征了一种具有碱性耐受性的PET降解细菌。首先选用了具有已知PET降解能力的F4菌株作为母本菌株。接着，通过物理（紫外线辐射）和化学（LiCl）诱变相结合的方法增加菌株的遗传多样性。随后实施了多阶段的适应性进化方案，即在逐步升高的碱性压力（pH从9升至12）条件下，以PET作为唯一碳源进行连续培养。这一过程的目的是筛选出那些不仅具有更强碱性耐受性，还能保持并提升PET水解能力的突变体。最终得到的F6菌株经过了遗传稳定性检测、在碱性条件下的生长特性测试，以及在pH 10条件下降解PET纤维的催化性能评估。其降解效率与中性条件下的野生型菌株进行了比较，评估指标包括重量损失、产物释放情况以及降解后底物的结构变化。一旦这种化学与生物的协同作用得到验证，它将为处理含有PET的碱性工业废水提供一种实用且可能具有成本优势的方法——这类危险废物的现有治理技术十分有限。

章节节选

材料

在本研究中，Comamonas testosteroni F4菌株被用作整体细胞生物催化剂。该菌株最初是从活性污泥中分离出来的，因为它具备以PET作为唯一碳源生长的能力。我们的研究小组已经证明，F4菌株能够在中性pH条件下降解PET纤维，还能为PET织物的表面赋予特殊功能[38]、[39]。在以PET纤维作为唯一碳源的条件下（见表S1），该菌株的

经碱性适应的F6菌株对PET的强化降解作用

为了直接评估该工程菌株的降解能力，并区分碱性预活化作用和生物催化作用各自的影响，研究人员开展了一系列综合实验。通过对添加了PET粉末的培养上清液进行高效液相色谱分析，证实了F6菌株具有酯键水解能力。在处理过的样本中检测到了典型的水解产物——对苯二甲酸、间苯二甲酸乙二醇酯和邻苯二甲酸乙二醇酯，而在未接种的对照组中则没有检测到这些物质（见图S5）。为了直接比较F4菌株和F6菌株的水解能力，

结论

总之，本研究通过UV-LiCl诱变和适应性实验室进化技术，成功培育出一种高效的碱性耐受性整体细胞生物催化剂——Comamonas testosteroni F6菌株。该菌株在碱性条件（pH 10）下能够稳定生长，并显著提升PET的降解效率，其导致的PET重量损失为6.1 ± 0.8%，而野生型菌株在中性pH条件下的重量损失仅为2.4 ± 0.5%。选择pH 10的碱性环境，正是为了模拟现实世界中的工业

环境意义

PET碱减量处理、纺织生物加工以及PET化学回收过程都会产生含有持久性塑料的碱性废水（pH 9–11）。目前的生物修复方法在如此高的pH环境下无法发挥作用。Comamonas testosteroni F6菌株经过进化改良，能够在pH 10的条件下降解PET，其原理是利用碱性环境对酯键的预活化作用，形成一种自我强化的生物降解过程。通过这种协同作用，3天内就能使PET的重量损失达到6.1 ± 0.8%，同时纤维直径也能缩小到18.1微米，这一方法具有实用性，且可能具备成本优势

CRediT作者贡献说明

Meilin Cheng：研究实施、正式分析。Qiujin Li：资源获取、研究实施、数据整理。Xiuming Liu：监督指导、方法设计。Jixian Gong：论文撰写与编辑、资金筹集、概念构思。Zheng Li：监督指导、正式分析。Huiqin Li：结果验证、项目管理、概念构思。Haodong Wu：论文初稿撰写、可视化处理、方法设计、研究实施。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本研究得到了国家先进印染技术创新中心研究基金（ZJ2021B02）、邢台市关键研发项目基金（2022ZZ002）、天津市重点研发计划技术支撑类项目（20YFZCSN00130）以及河北省重点研发计划项目（23314001D）的资金支持。

Haodong Wu|Huiqin Li|Zheng Li|Xiuming Liu|Qiujin Li|Meilin Cheng|Jixian Gong

中国天津300387，天宫大学纺织科学与工程学院