在非小细胞肺癌中，砷反应性hsa_circ_0000118将早期应激颗粒的动态变化与后期NF-κB相关信号通路的适应机制联系起来

《Journal of Hazardous Materials》：Arsenic-responsive hsa_circ_0000118 couples early stress granule dynamics to later NF-κB-related signaling adaptation in NSCLC

　　

摘要

砷暴露与肺癌发生密切相关，但细胞如何从早期的应激缓冲状态转变为后期的适应性重塑机制仍不清楚。应激颗粒是在急性应激状态下形成的重要细胞质凝聚物，而砷反应性环状RNA是否参与非小细胞肺癌中的这一过程目前尚不明确。在本研究中，我们发现hsa_circ_0000118是一种砷反应性环状RNA，在暴露于砷的人体样本以及经亚砷酸处理的非小细胞肺癌细胞中均表现出上调趋势。抑制该RNA会降低细胞存活率、促进细胞凋亡、抑制细胞增殖，并增加细胞对持续砷应激的敏感性。从机制上看，急性亚砷酸暴露会先导致线粒体功能紊乱和应激颗粒的形成，随后才出现明显的细胞毒性。在这种环境下，失去hsa_circ_0000118会提高应激颗粒的易感性，同时延缓应激缓解后的颗粒清除速度。RNA结合蛋白QKI在这一过程中起上游调控作用，因为敲低QKI会降低hsa_circ_0000118的表达，减弱其与G3BP1相关复合物的结合，进而使细胞呈现对应激颗粒敏感的状态。而在持续砷应激条件下，失去hsa_circ_0000118则会扰乱核因子κB相关的适应性反应，表现为p105和p65蛋白积累，但下游与生存相关的信号传导却减弱。急性亚砷酸暴露后，P65还会与G3BP1阳性颗粒部分共定位，这表明早期应激颗粒的重塑与后期NF-κB相关信号传导异常之间可能存在空间上的关联。总体而言，hsa_circ_0000118既与急性应激颗粒的动态变化有关，也与持续砷应激下非小细胞肺癌细胞中NF-κB相关的生存信号传导有关。这些发现表明hsa_circ_0000118可能是砷相关应激适应过程中的关键成分。

引言

砷是一种已得到充分证实的环境致癌物。通过饮用水或职业接触长期暴露于砷会增加患肺癌的风险[1]、[2]。非小细胞肺癌是肺癌的主要类型，其发病不仅与遗传因素有关，还与长期的环境因素密切相关[3]。从生物学角度看，砷的作用具有明显的时间依赖性：急性高剂量暴露会迅速引发氧化应激和翻译抑制[4]；而慢性低剂量暴露则通过持续的DNA损伤、表观遗传改变以及信号通路重构，促使细胞发生恶性转化，从而使细胞获得异常的存活和增殖优势[5]、[6]。因此，砷相关的癌症发生是一个动态过程，细胞能否在最初的急性冲击后存活下来并适应慢性应激，将决定它的命运——是遭受不可逆的损伤还是发展成恶性细胞[7]。

对急性应激的最早反应之一就是应激颗粒的快速形成，这类无膜结构的核糖核蛋白凝聚物是在翻译停止时形成的[8]、[9]。应激颗粒由停滞的mRNA-核糖体复合物以及多种RNA结合蛋白组成，它们能暂时隔离转录本以调节翻译活动，在应激解除后会重新解聚[10]。亚砷酸钠是诱导应激颗粒形成的经典物质，也是研究氧化应激相关翻译抑制的常用模型[4]。值得注意的是，亚砷酸钠会在细胞明显死亡之前就引发线粒体功能紊乱和应激颗粒的形成[8]、[11]。应激颗粒处于细胞器应激、翻译抑制以及适应性生存信号传导之间的关键节点上[12]、[13]、[14]。许多RNA结合蛋白，如QKI、DEAD-box螺旋酶3 X连锁基因编码蛋白DDX3X以及CUGBP Elav样家族蛋白CELF，都会在应激作用下发生分布变化，并参与应激颗粒相关的核糖核蛋白重塑过程[15]、[16]、[17]。这些观察结果表明，RBP-应激颗粒调控网络可能影响着早期砷应激适应以及后续的细胞反应[13]。

如果将应激颗粒视为应激状态下的翻译“枢纽”，那么上游的RNA调控网络很可能负责控制它们的形成、解聚以及由此产生的下游信号传导效应。环状RNA是一类通过反向剪接产生的非编码RNA，其特征为共价闭环结构、高稳定性以及组织特异性[18]、[19]。近年来，环状RNA已被确认为各种环境应激和细胞内应激的关键传感器，它们通过与miRNA或RNA结合蛋白相互作用，将这些应激信号转化为细胞增殖和代谢重编程等功能性结果[20]、[21]。鉴于其稳定性以及与肿瘤表型的关联，环状RNA有望成为连接环境暴露与肿瘤细胞状态的分子桥梁[20]。不过，它们在砷诱导的非小细胞肺癌中的作用尚未明确[22]、[23]。具体而言，砷反应性环状RNA究竟是参与应激颗粒相关的应激适应，还是影响关键信号通路的重塑，目前仍不清楚。

基于以上情况，我们选择了hsa_circ_0000118作为研究对象，这是一种在砷暴露人群中被发现的砷反应性环状RNA，也在经砷处理的非小细胞肺癌细胞中得到了进一步验证。功能实验显示，敲低该RNA会降低细胞存活率、促进细胞凋亡并抑制细胞增殖，更重要的是，它还会让细胞对慢性砷暴露更为敏感。从机制上看，我们的数据支持一种分阶段作用的模型：在急性砷应激条件下，失去hsa_circ_0000118会提高细胞对应激颗粒积累的敏感性，同时延缓其解聚，这一过程涉及到QKI和G3BP1复合物的重塑；而在慢性砷应激条件下，敲低该RNA则会扰乱NF-κB信号通路，尤其会影响NFKB1/p65轴的蛋白质平衡。综合这些结果，我们可以认为hsa_circ_0000118是连接非小细胞肺癌中早期应激颗粒相关应激缓冲与后期砷应激下信号适应之间的关键分子纽带。

章节节选

研究人群与样本收集

本研究纳入了某砷相关企业的员工以及该地区没有职业接触史的居民作为研究对象。所有参与者均签署了知情同意书，该研究也获得了昆明医科大学伦理委员会的批准。纳入标准要求参与者年龄在18至65岁之间，且在当地居住至少5年；排除标准包括有其他重金属接触史、近期有重大疾病史或处于妊娠期。研究还收集了参与者的人口统计学信息和职业相关数据

hsa_circ_0000118在人体样本中与砷暴露相关，且在非小细胞肺癌细胞中也会被诱导表达

我们采用了两阶段的基于候选基因的qPCR筛选策略，来识别可能与砷暴露相关的非编码RNA。在最初评估的81个候选基因中，有19个符合进一步开展群体水平分析的标准。在这些候选基因中，hsa_circ_0000118表现出较高的检测率、相对较高的表达水平、稳定的扩增效果，且在砷暴露组中呈现出可重复的上调趋势。在99例砷暴露样本中，有98例都检测到了该RNA

讨论

在人类样本中，hsa_circ_0000118始终与砷暴露存在关联，这体现在暴露组中该RNA水平升高、随着尿砷浓度分位数的增加其水平也逐渐上升，同时还与尿中的砷化合物种类以及甲基化相关指标呈正相关。这些发现支持砷暴露程度与hsa_circ_0000118表达之间存在暴露-反应关系。与群体水平的研究结果一致，亚砷酸处理也会诱导hsa_circ_0000118的表达上升

伦理声明

本研究已经获得了昆明医科大学伦理委员会的批准，所有参与者都签署了书面知情同意书。如需，可提供伦理审批的相关证明文件。

资金支持

本研究得到了国家自然科学基金的资助（项目编号：82160607）。

作者贡献说明

段婷志：数据整理。杨新达：数据整理。陈斌：实验研究。何月峰：结果验证。谭静文：初稿撰写。刘娜：文章审阅与编辑。张渊：文章审阅与编辑。朱艳华：文章审阅与编辑。杨景超：初稿撰写。杨学飞：初稿撰写。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。

Jingwen Tan|Na Liu|Yuan Zhang|Yanhua Zhu|Jingchao Yang|Xuefei Yang|Tingzhi Duan|Xinda Yang|Bin Chen|Yuefeng He

中国云南省昆明医科大学公共卫生与生物安全重点实验室