哮喘小鼠模型中不同颗粒物诱导的支气管相关淋巴组织形成与肺炎症的时间依赖性分析

《Journal of Hazardous Materials》：Time-dependent analysis of bronchus-associated lymphoid tissue formation and pulmonary inflammation induced by various particulate matter in asthmatic mice model

　　

摘要

颗粒物会加重包括哮喘在内的呼吸系统疾病，还会促使支气管相关淋巴组织形成。然而，不同类型的颗粒物对肺部炎症及BALT发展的时间效应至今尚不清楚。本研究探讨了三种颗粒物——二氧化钛纳米粒子、柴油机尾气颗粒以及亚洲沙尘——在存在/不存在过敏原卵清蛋白的条件下，对肺部炎症及异位淋巴组织发展随时间变化的影响。所有类型的颗粒物都能促进BALT的形成，与卵清蛋白共同作用时其发展更为显著。在接触过敏原的小鼠中，最初会出现白细胞介素-1α水平上升，随后出现2型免疫反应及BALT扩张。而在无过敏原环境下，尽管没有初期白细胞介素-1α的升高，但充足的C-X-C基序趋化因子配体1生成以及中性粒细胞的聚集仍有助于BALT的形成，尤其是在反复接触二氧化钛之后。3D肺重建结果显示，在接触二氧化钛的卵清蛋白处理组中，BALT及三级淋巴结构的发育从大气道延伸至更远的区域。二氧化钛可在肺泡、肺泡巨噬细胞、BALT区域以及肺门淋巴结中被检测到。这些发现表明，白细胞介素-1α的早期升高、充足的CXCL1生成以及中性粒细胞浸润，会以时间依赖性和环境依赖性的方式促进颗粒物诱导的BALT形成。

引言

空气中的颗粒物作为一种严重的公共卫生问题，因其普遍存在且会对人体健康造成危害，包括引发哮喘等呼吸系统疾病，而日益受到全球关注[1]、[2]、[3]、[4]。颗粒物包含多种化学成分，既来自人为来源，也来自自然来源[5]、[6]。鉴于环境中颗粒物的多样性，本研究选择了二氧化钛纳米粒子、柴油机尾气颗粒以及亚洲沙尘作为典型的模型颗粒物，而非所有颗粒物成分的全面代表。这类颗粒物包括成分相对均匀的无机纳米粒子、柴油发动机燃烧产生的颗粒物，以及天然矿物粉尘相关的颗粒物，便于比较。这类颗粒物会对肺部造成损害[7]、[8]、[9]、[10]、[11]；不过，不同类型颗粒物的差异性作用及其对肺部免疫功能的时间依赖性影响目前尚未完全明了，因为大多数研究仅基于单时间点的观察，且往往只聚焦于某一种颗粒物，而非进行对比性的时间依赖性分析。

支气管相关淋巴组织属于三级淋巴结构的一种，存在于人类和小鼠的支气管附近[12]、[13]、[14]、[15]。典型的BALT结构由有序的B细胞区、独立的T细胞区、高内皮静脉以及淋巴管组成。虽然在正常生理状态下这些异位淋巴细胞聚集体并不存在，但在慢性炎症状态、感染性疾病或肿瘤情况下会出现，并有助于宿主的免疫反应[14]、[15]。从组织学角度看，颗粒物会引发呼吸上皮的形态变化，如杯状细胞增生和黏液分泌过多[16]、[17]、[18]。此前也有研究指出，颗粒物会通过导致肺泡巨噬细胞死亡，进而释放作为损伤相关分子模式的白细胞介素-1α，从而促使BALT形成[19]。这一信号会使2型辅助T细胞发生极化，最终促进BALT的形成。不过，白细胞介素-1α水平上升与BALT形成的时间关系，以及不同类型颗粒物是否存在不同的时间模式，目前仍不明确。由于颗粒物会引发复杂的免疫反应，除了白细胞介素-1α之外，还有其他通路可能参与BALT的形成，这一机制也尚未被探索。例如，吸入的颗粒物会被呼吸道上皮和肺泡巨噬细胞表面的模式识别受体识别，进而触发先天性和适应性免疫反应的级联反应[19]、[20]。肺泡巨噬细胞会吞噬这些外来物质，并释放促炎细胞因子，如白细胞介素-1α和肿瘤坏死因子-α，这些因子会增加血管通透性，促进免疫细胞进入肺部[21]、[22]、[23]。这些细胞还会分泌趋化因子，如C-X-C基序趋化因子配体1和C-C基序趋化因子配体11，分别吸引中性粒细胞和嗜酸性粒细胞[24]、[25]。这些粒细胞会造成组织损伤、细胞破坏并调节免疫反应，而嗜酸性粒细胞引发的炎症则会因2型辅助T细胞产生的细胞因子，如白细胞介素-5和白细胞介素-13而加剧[26]、[27]、[28]、[29]。此外，还有研究表明CXCL1会影响淋巴内皮细胞的迁移和淋巴管生成，可能在炎症组织的重塑中发挥作用[6]、[30]。另外，BALT/三级淋巴结构的形成是一个动态的、时间依赖性的过程，涉及先天免疫的激活、免疫细胞的募集以及淋巴结构的逐步形成[12]、[13]、[14]、[15]。因此，进行时间维度上的分析对于理解BALT发展的机制至关重要。

除了时间动态因素外，颗粒物在肺组织中的分布位置也可能对BALT的形成及相关炎症反应产生重要影响。不过这一问题尚未得到充分研究。这一知识空白尤为重要，因为颗粒物具有多种物理化学性质，可能会影响其沉积的位置。例如，颗粒物可能滞留在支气管内，渗入肺泡区域，进入淋巴系统，或者进入血液[31]、[32]、[33]。因此，对颗粒物分布的空间分析，有助于了解反复接触颗粒物如何引发局部的炎症反应和淋巴组织变化。

本研究采用气管内灌注小鼠模型，探讨不同类型颗粒物对肺部炎症及BALT形成的时间效应。BALB/c小鼠根据灌注次数被分为四组（1次–4次）。研究了三种不同类型的颗粒物：二氧化钛、柴油机尾气颗粒以及亚洲沙尘，每种颗粒物的暴露情况又分为接触卵清蛋白组和未接触卵清蛋白组，以此评估其在有/无过敏原条件下的影响。我们分析了这些因素的作用，重点研究了累积颗粒物暴露如何影响炎症的发展、免疫细胞的募集（巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞）、细胞因子和趋化因子的表达（白细胞介素-1α、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-5、白细胞介素-13、CXCL1和CCL11）、杯状细胞的增殖以及BALT/三级淋巴结构的形成。此外，我们还研究了经过累积灌注后，成分相对均匀、可通过拉曼显微镜精准检测的二氧化钛在肺部的空间分布情况。

章节节选

体内实验与颗粒物制备

这项时间依赖性分析实验包含了三个关键变量：三种不同的颗粒物类型（二氧化钛、柴油机尾气颗粒或亚洲沙尘）、是否存在卵清蛋白，以及作为时间依赖性因素的气管内灌注累积次数。

本研究中使用了三种类型的颗粒物：亚洲沙尘、二氧化钛和柴油机尾气颗粒。亚洲沙尘是从日本茨城县的环境研究所购买的认证参考物质30号（戈壁科萨沙尘）。金红石型二氧化钛则来自坂井化学公司的STR-100N产品

反复接触颗粒物会根据颗粒物类型和卵清蛋白存在状态，引发不同的巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞募集模式

我们比较了不同组别BALF样本中的细胞群体，尤其是三种主要的炎症细胞：巨噬细胞（图2A–D）、中性粒细胞（图2E–H）和嗜酸性粒细胞（图2I–L）。在未接触颗粒物的动物中，仅接触卵清蛋白就会在4次灌注后导致巨噬细胞和嗜酸性粒细胞显著增加（图2A,I）。相比之下，卵清蛋白对中性粒细胞的影响出现得更早，1次灌注时就会出现显著增加，且在2次、3次和4次灌注时这种增加趋势依然存在（图2E）。

在接触二氧化钛的

讨论

在本研究中，我们全面分析了在不同卵清蛋白处理条件及无卵清蛋白条件下，不同类型颗粒物对小鼠模型肺部炎症及BALT形成的时间依赖性影响。总体而言，BALT的形成是在颗粒物暴露后随着时间逐渐发展的。在接触卵清蛋白的情况下，三种类型的颗粒物都会在反复暴露后导致BALT数量逐渐增加。而在无卵清蛋白条件下，只有反复接触二氧化钛后才会出现BALT的显著增加

结论

我们的研究结果表明，颗粒物诱导的BALT形成会随着反复暴露而逐步加重，在接触卵清蛋白的情况下，早期的白细胞介素-1α水平升高会促进BALT的发展；而在没有卵清蛋白的情况下，BALT的形成则与充足的CXCL1生成以及大量中性粒细胞的聚集密切相关。在接触卵清蛋白的情况下，2型免疫反应会与BALT的形成同步增强，但并非直接推动其形成。此外，3D重建还提供了额外的空间信息

环境意义

本研究表明，反复接触颗粒物会导致肺部免疫结构发生渐进且持续的变化，而不仅仅是短暂的炎症反应。这些发现说明，颗粒物污染的健康影响可能会随时间积累，还会引发肺部免疫系统的结构改变。所观察到的时间依赖性反应强调了在评估颗粒物的生物学影响时，需要考虑暴露的持续时间和历史背景。这类影响

作者贡献说明

宫坂夏子：写作——审稿与编辑，实验研究。贞金香织：写作——审稿与编辑，实验研究。奥沃科尼兰奥卢瓦托因：写作——审稿与编辑，实验研究。长尾惠：写作——审稿与编辑，实验研究。本多明子：写作——审稿与编辑，监督工作，方法学研究，实验研究，概念设计。松田智成：写作——审稿与编辑，监督工作。邱宾阳：写作——审稿与编辑，实验研究。刘伟：写作——审稿与编辑，

资金支持

本研究得到了日本科学技术厅的进化科学和技术核心研究项目（CREST）的资助，项目编号为JPMJCR19H3，同时还获得了日本学术振兴会的KAKENHI项目资助，项目编号分别为24K02684和25K22705。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的财务利益关联或个人关系。

致谢

我们要感谢大畑凉子在技术方面的协助，同时也要感谢Editage公司提供的英文润色服务（网址：www.editage.jp）。

刘伟|本多明子|森本千寻|一之濑隆道|林学|三上良和|石川拉加|贞金香织|宫坂夏子|长尾惠|奥沃科尼兰奥卢瓦托因|邱宾阳|松田智成|高野宽久

日本京都大学工程研究生院环境工程系，京都606-8501