锌与不同类别的抗生素共同作用会引发活性污泥中微生物群落的显著重构

《Journal of Hazardous Materials》：Zinc co-exposure with different antibiotic classes drives distinct microbial community restructuring in activated sludge

　　摘要：抗生素与重金属在污水处理系统中常常同时存在，但它们对活性污泥微生物组的共同影响除了多样性及分类组成变化外，其内在机制仍不明确。本研究利用实验室规模的活性污泥反应器，在恒定锌浓度的条件下，通过逐步增加抗生素浓度，探究锌、环丙沙星、磺胺甲噁唑及其混合暴露对微生物的影晌。通过16S rRNA基因扩增子测序、差异分类分析、共现网络分析以及基于iCAMP的组装推断方法对微生物群落进行特征分析。与单一污染物处理相比，混合暴露会导致更高的α多样性损失，且群落分离度更明显，其中锌加环丙沙星的效应最为显著。随着胁迫强度的增加，共享的扩增子序列变异体数量减少，结构零分析表明，敏感菌属逐渐无法被检测到，尤其是在较高浓度阶段。两种混合处理方式呈现出不同的重构模式：锌加环丙沙星表现为少数菌属的反复变化，且在最高浓度阶段脱氯单胞菌显著富集；而锌加磺胺甲噁唑则导致更多菌属的重新分布，但没有出现类似的优势替代菌属。共现网络分析进一步显示，锌加环丙沙星形成的网络较为稀疏，而锌加磺胺甲噁唑的网络密度更高、模块性更低。此外，群落组装分析表明，在混合暴露条件下，从强烈的同质选择向更大的随机性作用转变，锌加环丙沙星中以扩散限制为主，而锌加磺胺甲噁唑则以漂变作用更为显著。这些发现表明，锌与不同类别的抗生素结合可引发活性污泥微生物组不同的生态演变路径，为预测混合污染物如何影响污水处理系统中的微生物稳定性、恢复能力及处理效果提供了生态学依据。

引言：抗生素在人类医疗和动物养殖领域被广泛使用，其持续排放导致其在水环境中普遍存在[1][2][3]。污水处理厂，尤其是活性污泥系统，被认为是这些污染物积累、转化和再分布的重要场所[4][5]。与此同时，通过医疗、工业及畜牧业废水输入，重金属也常与抗生素在这些系统中共存[6]。与许多有机污染物不同，重金属难以降解，容易在污泥中积累，从而对其中的微生物施加持续的选择压力[7][8]。因此，抗生素与重金属的长期共存可能重塑活性污泥微生物群落，进而影响生物处理的稳定性和生态系统功能[9][10]。在常见检测到的抗生素中，环丙沙星和磺胺甲噁唑分别是氟喹诺酮类和磺胺类药物的环境代表性物质[11][12]。在以源头污染为主的废水中，这两种抗生素的浓度可能显著升高。据报道，畜牧业废水中磺胺甲噁唑的浓度可接近10毫克/升，而来自大规模药物生产企业的废水中的环丙沙星浓度甚至可达31毫克/升[13][14]。尽管这些浓度对应的是高度污染的源头水，而非典型的城市污水，但它们表明在高风险废水环境中，这两种抗生素都可能达到毫克/升的水平。此外，环丙沙星和磺胺甲噁唑在活性污泥系统中的行为也存在显著差异。氟喹诺酮类通常会强烈吸附在污泥固体上，而磺胺类药物则更具流动性，可能经历不同的去除和转化途径[4][15]。这些差异意味着它们可能会对污泥微生物产生不同的暴露机制和选择压力[16]。锌是污水处理系统中的典型重金属污染物，它来源于多种渠道，包括畜牧业生产和工业排放，且常常与抗生素在废水环境中共存[17][18]。具体而言，环丙沙星和磺胺甲噁唑都在畜牧业废弃物和粪肥肥料中被检测到与锌一同存在，这为锌与氟喹诺酮类或锌与磺胺类药物的共存场景提供了环境依据[19][20]。因此，将锌与不同类别的抗生素结合，可为研究金属与抗生素的共存是否会导致活性污泥微生物组出现因抗生素类别而异的响应提供合适的模型。以往的研究表明，抗生素和重金属能够改变活性污泥群落，但其效应往往具有污染物特异性[17][21][22]。在5.0毫克/升的环丙沙星长期暴露条件下，化学需氧量去除效率、氮代谢都会受到抑制，同时活性污泥微生物群落也会发生显著变化，这说明氟喹诺酮类的胁迫会影响群落组成以及参与氮循环的关键功能群体[23]。锌在序批式反应器中也会表现出浓度依赖性的效应：较低浓度的锌离子可能增加微生物的丰富度和多样性，而较高浓度则会抑制氮去除作用，并减少脱氯单胞菌、硝化螺菌和硫氧化菌等与反硝化相关的菌属[24]。磺胺类药物的表现则可能有所不同。在暴露于环境浓度水平的磺胺甲噁唑的反应器中，处理性能基本保持稳定，但经过长时间暴露后，细菌群落组成会发生改变[25][26]。这些研究结果表明，不同污染物可通过不同的生态途径重塑活性污泥群落。以往也有研究探讨过抗生素与重金属对活性污泥系统的共同影响，主要关注处理性能、微生物群落变化以及抗生素耐药性等方面[9][21]。例如，环丙沙星与铜的混合暴露会改变硝化作用，并在胁迫期间及胁迫后导致细菌多样性和群落结构发生显著变化[27]。然而，现有研究大多仅关注混合污染物是否比单一污染物会产生更严重的不良影响，较少研究在连续运行过程中逐渐加剧的暴露条件下微生物响应的发展情况，以及混合处理与相应单一污染物处理之间的差异程度[22]。此外，污水处理系统接收的抗生素与金属混合物在成分和暴露强度上可能存在差异[9][18]，因此某种污染物组合所观察到的生态响应可能不适用于另一种组合。因此，仍有必要明确不同抗生素与金属的组合是否遵循相似或不同的生态重构模式。仅依靠组成变化无法完全揭示污染物暴露如何重新组织微生物群落。近期在活性污泥及其他工程化生物反应器中的研究表明，网络分析和群落组装分析能为扰动条件下的群落重构提供互补性的见解[28][29][30][31]。网络分析有助于了解潜在微生物关联的变化，而群落组装分析则能区分决定性过程和随机过程的相对贡献。这些方法有助于超越单纯的分类学描述，评估污染物暴露如何改变微生物群落的生态结构。不过，长期锌与不同类别抗生素共存所带来的生态后果仍未完全阐明，尤其是在能够进行单一抗生素处理与锌加抗生素处理之间分阶段比较的实验设计下。本研究利用实验室规模的活性污泥反应器，探讨了锌、环丙沙星、磺胺甲噁唑及其混合暴露对微生物群落的影响。通过逐步提高环丙沙星和磺胺甲噁唑的浓度，模拟从高暴露或污染严重环境到持续高胁迫的梯度条件，同时保持锌浓度恒定作为共存背景。这种设计使得我们能够在相同的抗生素浓度阶段比较锌加环丙沙星与环丙沙星单独处理的情况，以及锌加磺胺甲噁唑与磺胺甲噁唑单独处理的情况，从而区分锌共存效应与抗生素本身带来的阶段效应。本研究结合高通量16S rRNA基因测序、差异分类分析、共现网络分析以及群落组装分析，全面评估多样性、分类结构、微生物关联模式及组装过程的变化。我们的假设包括：（1）锌与抗生素的混合暴露会比单一污染物暴露导致更严重的群落多样性丧失和更显著的组成重构；（2）在相同的锌浓度背景下，由于环丙沙星和磺胺甲噁唑的环境行为不同，它们会引发不同的微生物重构模式；（3）混合暴露不仅会改变群落组成，还会影响微生物的共现模式以及组装过程的相对贡献。通过在同一金属背景下、在不同暴露阶段明确比较两种锌加抗生素的组合，本研究旨在阐明抗生素的类别特性如何影响活性污泥系统中混合污染的生态后果。

实验部分：活性污泥反应器的设置与运行：本研究使用的初始活性污泥取自中国北方的一家城市污水处理厂。经过离心去除上清液后，将污泥分装到1升的棕色试剂瓶中，再用合成废水将工作体积调整至500毫升。为减少外部因素的干扰并降低实验变异性，合成废水是根据污水进水特征及微生物营养需求配制的。

反应器性能与污染物动态：在用合成废水培养15天后，各反应器中的化学需氧量及氨氮去除效率均保持相对稳定（见图S1A），这说明在污染物暴露之前，反应器的运行状态已基本稳定，但微生物群落尚未完全定型。在暴露阶段，每个72小时的运行周期内，化学需氧量都会迅速下降，大多数处理方式的最终去除效率均超过95%（见图S1B）。不过，化学需氧量的下降速度较慢……

综合胁迫带来的生态扰动比单一胁迫更严重：本研究表明，锌与抗生素的混合暴露对活性污泥群落的生态影响比单一胁迫更为严重。这不仅体现在较低的α多样性上，还表现为共享的扩增子序列变异体逐渐减少、不同处理阶段之间的群落差异日益明显，以及混合处理条件下结构零现象的出现频率更高。这些特征表明，综合胁迫并非简单改变原有菌属的相对丰度……

结论：本研究表明，锌与抗生素的共存对活性污泥微生物群组造成的生态扰动比单一污染物暴露更为严重。这种扰动不仅体现为多样性下降，还表现为微生物群落关联模式和共现结构的逐步变化——随着胁迫加剧，敏感菌属逐渐无法被检测到，而耐受性菌属则越来越占优势。在相同的锌浓度背景下，环丙沙星……

环境意义：抗生素与重金属在污水处理系统中普遍共存，尤其是在受源头污染或污染严重的废水中。然而，仅通过单一污染物的反应无法可靠推断它们对活性污泥微生物组的共同影响。本研究表明，锌与不同类别的抗生素共存可引发不同的微生物重构路径，进而改变群落组成、潜在的关联模式以及微生物的组装过程。

作者贡献说明：罗江晓：可视化、方法学、数据整理；袁蒙博：方法学、实验研究、定量分析；文伟：方法学、实验研究、数据整理；李永超：软件工具、方法学、实验研究、数据整理；董世杰：写作——审稿与编辑、软件工具、实验研究；李宇昂：写作——初稿撰写、可视化、方法学、实验研究、定量分析；赵仁新：写作——审稿与编辑、项目监督与管理、方法学、资金支持。

利益冲突声明：作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢：本研究得到了国家自然科学基金（22106086）、内蒙古自治区高校青年科技人才计划（NJYT25008）、内蒙古自治区科学技术计划（2025KYPT0119）、内蒙古大学的俊马计划以及内蒙古自治区研究生科研创新项目（KC2025009S）的支持。

作者名单：李宇昂、董世杰、李永超、文伟、袁蒙博、罗江晓、石斌、赵仁新
地址：中国呼和浩特市010021，内蒙古大学生态与环境学院，内蒙古污染控制与低碳资源利用重点实验室