采用经过验证的RP-HPLC方法对帕博西尼进行强制降解研究，并通过LC-HRMS分析明确降解途径及特征杂质：一种制剂前研究方案

《Journal of the Indian Chemical Society》：Forced Degradation Studies of Palbociclib using Validated RP-HPLC Method and Elucidation of Degradation Pathways and Qualifying Impurities using LC-HRMS Analysis: A Preformulation Protocol

　　•帕博西尼是一种用于治疗转移性人类表皮生长因子受体-2阴性（HER2?）/激素受体阳性（HR+）乳腺癌的口服靶向疗法。•口服疗法的常见副作用是中性粒细胞减少症，这需要暂停用药。为减轻口服疗法的局限性，负载PLGA的帕博西尼肌肉注射制剂提供了一种替代剂型，可降低服药负担并减少血浆药物浓度的波动。•研究人员利用该药物、药物/PLGA预混物以及市售口服片剂，开发并验证了反相高效液相色谱法。该方法还被用于在各种恶劣条件下的强制降解研究，包括温度、酸度、碱性环境、氧气及光照条件。•液相色谱高分辨率质谱分析揭示了不同强制降解条件下的降解产物，进一步的质谱碎片分析则为了解降解途径提供了详细信息。

引言
乳腺癌是全球女性中最常见的癌症类型之一，也是导致癌症相关死亡的主要原因。根据世界卫生组织的数据，2020年全球约有2,300,000例新诊断的乳腺癌病例，685,000人因此死亡[1]。在各类分子亚型中，人类表皮生长因子受体-2阴性（HER2?）/激素受体阳性（HR+）乳腺癌占所有乳腺癌病例的60%-70%。周期蛋白依赖性激酶的失调在乳腺癌的细胞异常增殖和肿瘤进展中起着重要作用。因此，通过帕博西尼选择性抑制CDK4/6酶，已成为恢复细胞周期调控、抑制肿瘤生长的重要治疗策略[2]。

活性药物成分的稳定性是影响药品研发、生产及商业化过程中安全性、有效性及质量的关键因素。药品在储存期间以及制造、存储和运输过程中可能会发生降解，从而产生降解产物及相关杂质[3]。这些杂质可能带来严重的安全风险，影响产品稳定性，并干扰治疗效果。在某些情况下，这些杂质还可能具有毒理学或致突变性，需要在药品研发过程中进行严格监测[4]。了解药品在不同环境及应力条件下的降解行为和内在稳定性特征，对于制剂开发、包装选择、储存建议以及保质期确定具有重要意义[5]。应力测试被广泛用于确定药品的稳定性特征，并识别各种应力条件下的潜在降解途径[6]。这类研究还有助于证明分析方法在存在杂质和其他辅料时的特异性及稳定性检测能力。国际协调会议制定了关于药品稳定性研究、杂质分析及分析方法验证的指南。ICH Q1A(R2)涉及用于检测药品及产品稳定性的应力测试[7]。ICH Q2(R2)则规定了分析方法的验证参数，如特异性、精密度、准确度、稳健性和线性[8]。ICH Q3A(R2)和Q3B(R2)等指南提供了关于药品及成品中杂质识别与管理的详细信息[9]、[10]。ICH M7(R2)则针对具有潜在致癌风险的致突变性杂质进行了规定[11]。此外还有光稳定性测试以及ICH Q1B和Q1E规定的稳定性数据评估方法[12]、[13]。这些指南体现了稳定性检测方法及杂质分析在药品分析和监管研究中的重要性。

在药品研究中，色谱法和质谱法被广泛用于分析药品的稳定性及杂质生成情况。反相高效液相色谱法因其能够实现有效分离并精确测定分析物含量，而被视为分析药品化合物的理想技术[14]。对于更深入的特性分析，液相色谱-质谱法和液相色谱-高分辨率质谱法被广泛应用，以获取降解产物及相关杂质的分子量信息和裂解模式。这些技术尤其适用于识别和定量那些在常规色谱分析中难以检测到的、存在于样品基质中低浓度且结构不明的化合物[15]。将反相高效液相色谱法与基于质谱的技术相结合，可为评估药品的杂质谱、降解途径及稳定性特性提供有力手段。帕博西尼是一种口服有效的创新类药物，2015年获得美国食品药品监督管理局批准，可与内分泌疗法联合用于治疗HR+/HER2?晚期或转移性乳腺癌[16]。它属于吡啶并嘧啶酮类化合物（C24H29N7O2），分子量为447.54克/摩尔[17]。帕博西尼可通过抑制CDK4/6介导的视网膜母细胞瘤蛋白磷酸化，促使细胞停滞在G1期，从而抑制肿瘤细胞的增殖[18]。该药物以Ibrance为商品名，有75毫克、100毫克和125毫克规格的口服胶囊和片剂形式上市，每日服用一次[19]。帕博西尼被归类为生物药剂学分类系统II类药物，因此其吸收受溶解速率限制[20]。该药物的溶解度随pH值变化，脂溶性处于中等水平（log P为3.0–3.5），pKa值为7.4。帕博西尼主要通过细胞色素P450（CYP3A）介导的途径在肝脏中发生代谢，这会导致其口服生物利用度降低，药代动力学参数也出现较大差异[21]。这些物理化学性质和药代动力学特征会影响药物的制剂性能、稳定性、溶解度以及分析结果。长期口服该药物可能会影响患者的用药依从性，因此人们致力于开发更先进的药物递送系统及缓释制剂。为克服帕博西尼相关的生物药剂学限制，近年来人们研究了多种制剂方案，包括聚合物纳米粒子、脂质基体系、胶束载体以及长效注射用储库制剂[22]、[23]、[24]、[25]。然而，这类制剂的开发往往面临诸多挑战，如氧化降解、药物与辅料的不相容性、杂质生成、提取效率下降，以及难以在复杂基质中准确测定药物浓度等。对现有文献的梳理表明，已有多种分析方法，包括反相高效液相色谱法和液相色谱-质谱/质谱法，被用于检测原料药、生物样本以及市售制剂中的帕博西尼含量（见表1）。尽管这些方法能够满足常规检测和生物分析的需求，但许多研究主要侧重于药物含量的测定，而对应力条件下的全面降解行为及杂质分析关注不足。此外，目前仅有少数研究通过质谱法对帕博西尼的降解产物进行结构分析，尤其是在药物更容易发生降解的氧化条件下。另外，这些分析方法在聚合物长效注射制剂中的应用情况也尚未得到充分研究。尽管绿色分析化学理念日益受到重视，但分析方法在环境可持续性方面的表现，如溶剂消耗量和有害废物产生量等，仍未能得到足够关注。本研究的目的是开发一种稳健、具备稳定性检测功能的分析方法，以实现精确的定量分析及杂质监测，同时为制剂开发、工艺优化及日常质量控制提供支持。

因此，本研究旨在开发并验证一种简单、灵敏、具备稳定性检测功能且环保的反相高效液相色谱法，用于帕博西尼的定量测定。研究人员在酸性、碱性、光解、氧化及热应力条件下进行了强制降解实验，以研究该药物的内在稳定性特征。鉴于帕博西尼极易发生氧化降解并产生杂质，研究特别重点关注了氧化应激相关研究。在应力试验过程中产生的降解产物及相关杂质，随后通过液相色谱-质谱分析法进行了鉴定和结构分析。文献检索显示，目前大多数基于质谱的分析方法都是为生物分析应用而开发的，具体列表见表1。研究人员还对检测到的杂质进行了计算机模拟毒性分析，以评估其毒理学风险及安全性。经过验证的分析方法还被用于测定药品制剂及聚合物混合物中的帕博西尼含量。此外，还使用专门的绿色分析化学软件对该色谱分析方法的环境友好性进行了评估。本研究为帕博西尼的稳定性评估、杂质分析、降解途径研究以及杂质毒性初步评估提供了完整的分析方案，有助于提升药品质量管控水平、确保符合监管要求，并推动制剂研究的发展。

试剂与材料
帕博西尼（批号：PN23110013；生产日期：2023年7月11日；批量为34.7千克，由印度海得拉巴的Hetero Labs Limited公司生产），由印度泰伦加纳邦的雷迪实验室公司慷慨提供。所收到的帕博西尼被认定为内标，存放在-20℃环境中以备使用。所用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）有多种规格，如酯端封端的PLGA 50:50（批号X00253）、酸端封端的PLGA 50:50（批号X00134）以及PLGA 65:35。

反相高效液相色谱法的开发与优化
由于帕博西尼具有脂溶性，为使其良好保留，需使用非极性固定相；为此选择了C18柱。该柱由于长度较长，能够实现良好的分离效果，同时也有助于在强制降解试验后进一步纯化杂质。流动相由pH值为6.5的0.03 M醋酸铵缓冲液组成，其中含有0.1%的三乙胺，以及体积比为55:45的乙腈，该流动相经过优化，可确保色谱分离效果稳定。

结论
本研究成功开发并验证了一种可用于帕博西尼定量分析的稳定性检测型反相高效液相色谱法。该方法能够有效将帕博西尼与杂质分开，且完全符合ICH的验证要求，无论是在线性、特异性、精密度、准确度还是稳健性方面，都显示出适用于质量控制应用。强制降解试验也证实了帕博西尼的稳定性。在本研究中，除了氧化条件外，其他条件下的……

作者贡献说明
拉胡尔·L·加吉比耶：数据整理。拉吉库马尔·马莱安迪：写作——审阅与编辑、研究指导、概念设计。安基特·库马尔：写作——审阅与编辑。萨达娜·迪亚加拉：数据整理。鲁图贾·苏里亚万希：写作——初稿撰写、概念设计。阿努莫尔·约瑟夫：写作——初稿撰写、数据整理。

数据可用性
本研究生成的数据集可在合理请求下从相应作者处获取。

利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究结果的任何财务或个人利益冲突。

资金支持
作者未获得任何用于本研究、论文撰写及发表的财务资助。

利益冲突声明
? 作者声明不存在任何已知的可能影响本文研究结果的财务利益冲突或个人关系。

致谢
我们感谢印度化学品和肥料部药品管理局的指导与支持。

鲁图贾·苏里亚万希|阿努莫尔·约瑟夫|安基特·库马尔|萨达娜·迪亚加拉|拉胡尔·L·加吉比耶|拉吉库马尔·马莱安迪