苹果中XBMD3基因的全基因组鉴定及XBMD32在干旱胁迫响应中的作用

《Horticulture Advances》：Genome-wide characterization of XBMD3 genes in apple and the role of XBMD32 in response to drought stress

　　

黄单胞菌抗性21结合蛋白3（XB3）基因家族编码具有RING-finger或U-box结构域的蛋白质，主要作为E3泛素连接酶（E3 ubiquitin ligases）发挥作用，对泛素介导的蛋白质降解和胁迫响应至关重要。本研究首次对苹果（Malus domestica）中XB3家族进行了全基因组鉴定和表征，发现10个成员，命名为XBMD3s。系统发育关系、染色体分布、基因结构、保守基序和启动子顺式作用元件的综合分析揭示了XBMD3家族的进化保守性和调控复杂性。组织特异性表达数据显示，XBMD31/31-1/31-2/31-3和XBMD35主要在根中表达，而XBMD32/32-1、XBMD33/33-1和XBMD34在叶片中优先表达。此外，所有XBMD3基因均响应干旱胁迫，其中XBMD32表现出最强的转录诱导，增幅超过4.3倍。功能表征表明，过表达XBMD32增强了转基因烟草植株的耐旱性，提高了抗氧化酶活性并减少了活性氧（ROS）积累。此外，研究人员通过农杆菌（Agrobacterium）介导的瞬时遗传转化获得了XBMD32过表达和XBMD32沉默的苹果植株。过表达植株更耐旱，而沉默植株表现出更敏感的表型。综上所述，这些发现强调了XBMD3家族在苹果适应干旱胁迫中的作用，为未来功能研究和耐旱性改良提供了基础。

**研究背景、问题与目的**
干旱胁迫是限制全球苹果（*Malus domestica*）产量和品质的主要非生物逆境之一，通过破坏光合作用、导致氧化损伤和细胞脱水，严重影响果树生长和可持续生产。尽管已有研究通过嫁接耐旱砧木、传统杂交育种、分子育种及施用植物生长调节剂等方法提升苹果耐旱性，但植物自身应对干旱的复杂适应机制（如渗透调节、气孔调控、信号转导及活性氧（ROS）清除系统）仍需深入解析。在分子层面，E3泛素连接酶（E3 ubiquitin ligases）通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）介导靶蛋白降解，在胁迫响应中发挥关键调控作用。黄单胞菌抗性21结合蛋白3（XB3）家族含有锚蛋白（ANK）重复序列和RING-finger/U-box结构域，被报道为RING型（真正有趣的新基因，RING）E3连接酶，参与泛素化介导的靶蛋白降解。拟南芥中XBAT35通过脱落酸（ABA）信号响应干旱胁迫，XBAT32调节乙烯生物合成以控制侧根发育，毛果杨中PtrXB38是调控不定根形成的关键枢纽基因。然而，苹果中XB3家族的组成、进化特征及在干旱胁迫响应中的生物学功能尚不清楚。本研究旨在对苹果XB3家族（命名为XBMD3）进行全基因组鉴定，分析其染色体分布、进化关系、基因结构和顺式调控元件，检测组织特异性表达及干旱胁迫下的表达模式，并重点解析最强诱导基因XBMD32在耐旱性中的功能。

**主要关键技术方法**（不超过250字）
研究采用了以下关键技术：1）利用HMMER v3.3.2软件基于XB3保守结构域的隐马尔可夫模型（HMM）扫描苹果全蛋白质组，并通过保守结构域数据库（CDD）和SMART进行验证，鉴定XBMD3家族成员；2）使用MEGA11软件采用邻接法（1000次自举）构建系统发育树，分析进化关系；3）通过PlantCARE分析启动子区（2000 bp）顺式作用元件；4）提取‘GL-3’苹果植株（可控环境生长室，23°C，14 h/10 h光暗周期，40–60%相对湿度）叶片RNA，以苹果酸脱氢酶（MdMDH）为内参，进行qRT-PCR（定量逆转录PCR）检测组织特异性表达及干旱胁迫（0、2、4、6、8 d）下的表达模式；5）构建XBMD32过表达载体（pCAMBIA2300）和RNA干扰载体（pK7GWIWG2D），通过冻融法导入农杆菌（*Agrobacterium tumefaciens*）菌株EHA105，采用叶盘法转化烟草（*Nicotiana benthamiana*），并通过真空渗透法（0.08 MPa，20 min）瞬时转化‘GL-3’苹果组培苗，获得转基因植株；6）测定电解质渗漏（EL）、相对含水量（RWC）、叶绿素含量、H₂O₂、O₂^?、丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性，结合DAB（3,3'-二氨基联苯胺）和NBT（氮蓝四唑）组织化学染色检测ROS积累。

**研究结果**
**全基因组鉴定与染色体定位**：通过HMMER筛选和保守结构域验证，在苹果基因组中鉴定出10个XBMD3基因，分别命名为XBMD31、XBMD31-1/2/3、XBMD32、XBMD32-1、XBMD33、XBMD33-1、XBMD34和XBMD35。编码蛋白长度380–512个氨基酸，分子量42–55 kDa，等电点（pI）5.3–8.34，脂肪族指数79.90–86.19，所有蛋白均呈亲水性（GRAVY值为负）。染色体定位显示这10个基因分布在9条染色体上，其中16号染色体含有两个基因（XBMD32-1和XBMD34），其余染色体各含一个。

**系统发育分析**：基于拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）、番茄（*Solanum lycopersicum*）、水稻（*Oryza sativa*）和苹果共30个XB3家族成员的邻接法系统发育树显示，这些成员分为4个亚家族，苹果XBMD3分别分布于亚家族I（2个）、II（2个）、III（2个）和IV（4个），表明进化保守性和潜在功能分化。

**基因结构与保守基序分析**：保守基序分析（MEME）鉴定出10个基序，XBMD32、XBMD32-1、XBMD33、XBMD33-1缺少基序6和9；XBMD34和XBMD35仅含基序1、2、4、8；而XBMD31及其旁系同源基因包含全部10个基序，提示结构变异。基因结构显示所有XBMD3基因均含非翻译区（UTR），可变编码序列（CDS）数量：XBMD31和XBMD31-1/?2/?3有8个CDS，XBMD35有9个，其余5个基因有10个CDS。

**顺式作用元件分析**：在启动子区域（2000 bp）鉴定出多种胁迫和激素响应元件，包括低温响应元件（LTR）、ABA响应元件（ABRE）、抗氧化响应元件（ARE）、MYB结合位点（MBS）、赤霉素响应元件（P-box和GARE）、水杨酸响应元件（SARE）和生长素响应区域（AuxRR-core）。XBMD31含最多预测元件（18个），XBMD31-1有17个，其余基因含6–13个，表明XBMD3参与胁迫响应调控。

**组织特异性与干旱胁迫表达模式**：qRT-PCR分析显示，XBMD31/31-1/31-2/31-3和XBMD35主要在根中高表达，而XBMD32/32-1、XBMD33/33-1和XBMD34在叶片中优先表达。干旱胁迫下，所有XBMD3基因在2 d时被诱导，其中XBMD32上调幅度最大（>4.3倍）；4 d时表达被抑制；6 d时多数基因再次上调（除XBMD32-1外）；8 d时所有基因表达再次下降。XBMD32显示出最强的干旱诱导表达模式。

**XBMD32过表达增强烟草耐旱性**：在转基因烟草（OE-XBMD32，表达量提高10–15倍）中，干旱处理15 d后，野生型（WT）叶片明显黄化，而OE植株保持较绿表型。OE植株的电解质渗漏（EL）显著低于WT，相对含水量（RWC）更高，丙二醛（MDA）含量更低，总叶绿素含量约高13%。DAB和NBT组织化学染色显示，干旱后OE植株叶片中H₂O₂和O₂^?积累较少，定量检测进一步证实OE植株中H₂O₂和O₂^?含量显著低于WT，而SOD和POD活性显著高于WT，表明XBMD32通过增强抗氧化酶活性、减少ROS积累正向调控烟草耐旱性。

**XBMD32正调控苹果植株干旱胁迫响应**：通过农杆菌介导瞬时转化获得苹果过表达（OE-XBMD32）和RNA干扰（Ri-XBMD32）植株。在350 mmol甘露醇渗透胁迫3 d后，OE-XBMD32植株萎蔫程度轻于对照（OE-EV），而Ri-XBMD32植株萎蔫更严重。生理指标测定显示，OE-XBMD32植株的EL和MDA含量低于OE-EV，总叶绿素含量较高；Ri-XBMD32植株则相反。此外，OE-XBMD32植株H₂O₂和O₂^?含量较低，SOD和POD活性较高；Ri-XBMD32植株则呈现相反趋势。这些结果证实XBMD32在苹果中正调控干旱胁迫耐受性。

**讨论与结论**
讨论部分指出，干旱胁迫通过引发生理生化紊乱严重限制植物生长发育，E3泛素连接酶介导的蛋白质泛素化是胁迫响应的重要调控层。本研究首次在苹果中鉴定出10个XBMD3基因，家族成员数量介于拟南芥（6个）和棉花（33个）之间，表明进化过程中存在物种特异性扩张或收缩。系统发育将成员分为4个亚家族，基序缺失（如XBMD32缺少基序6和9）可能导致其独特的调控能力，并解释其显著的干旱转录响应。启动子顺式元件分析发现大量激素和胁迫响应元件，与干旱诱导表达模式一致。功能验证表明XBMD32通过提高抗氧化酶活性、减少ROS积累和缓解氧化损伤正向调节耐旱性，与已报道的XB3家族成员（如水稻XB3、沙蒿AdZFP1、大豆GmANK114、辣椒CaKR1等）功能一致。结论总结：共鉴定出10个苹果XBMD3成员，分布于9条染色体；理化性质、进化关系、基因结构、保守基序和启动子顺式元件分析揭示了结构多样性和潜在调控复杂性；表达分析显示所有XBMD3基因响应干旱胁迫，其中XBMD32诱导最强；在转基因烟草和苹果中的功能表征证明XBMD32通过增强抗氧化酶活性、减少ROS积累和缓解氧化损伤正向调控干旱胁迫耐受性。这些发现为XBMD3基因在植物非生物胁迫响应中的功能作用提供了全面见解。