《Advanced Science》：Gαi1/3 Are Essential for BMP2-Induced Osteogenesis by Bridging BMP Receptors to the Gab1 Signaling Complex
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BMP2作为骨骼发育、稳态和修复的关键调控因子。此前，研究人员证明了Gαi1/3（G蛋白α亚基i1/3）不仅参与G蛋白偶联受体（GPCR）信号转导，还充当酪氨酸激酶受体信号传导的关键介导因子。然而，其在骨形成和BMP2信号传导中的作用仍不清楚。在本研
摘要翻译
BMP2作为骨骼发育、稳态和修复的关键调控因子。此前，研究人员证明了Gαi1/3（G蛋白α亚基i1/3）不仅参与G蛋白偶联受体（GPCR）信号转导，还充当酪氨酸激酶受体信号传导的关键介导因子。然而，其在骨形成和BMP2信号传导中的作用仍不清楚。在本研究中，研究人员报道Gαi1/3在老年骨质疏松症患者的骨组织中表达显著下调。Gαi1/3双敲除小鼠表现出骨骼发育延迟和骨量减少。机制上，Gαi1/3是BMP2信号转导所必需的，因为其缺失损害了BMP2下游信号传导。在骨髓间充质干细胞（BMSCs）中，Gαi1/3敲除抑制了BMP2诱导的成骨分化，而过表达则增强了成骨分化。在股骨骨折模型中，BMSCs中Gαi1/3的敲低降低了BMP2促进骨折愈合的能力。此外，在BMSCs中条件性敲除Gαi1/3的新生小鼠中，骨骼发育延迟。Gab1对于Gαi1/3介导的BMP2信号传导是不可或缺的，因为Gαi1/3同时结合BMP2受体和Gab1以介导BMP2的生物学功能。总之，研究人员的发现揭示了Gαi1/3-Gab1轴在BMP2信号传导和成骨中的关键作用，为骨质疏松症和骨修复提供了潜在的治疗靶点。
论文解读
**一、研究背景与科学问题**
骨形成是维持骨骼完整性和全身稳态的基础生理过程，确保骨骼系统正常发育、支撑身体结构、保护内脏器官并维持钙磷稳态。充足的成骨活性可预防老年性骨质疏松症，显著改善老年人生活质量，并促进骨折后的骨再生与修复。骨形成主要由骨髓间充质干细胞（BMSCs）驱动，涵盖成骨分化、类骨质分泌和矿化等连续阶段，这些过程受多种信号因子调控。其中，骨 morphogenetic protein（BMP）家族在成骨中发挥核心作用，BMP2作为转化生长因子-β（TGF-β）超家族的关键信号分子，通过激活胞内丝氨酸/苏氨酸激酶型I和II型BMP受体，启动下游多种信号通路，包括PI3K-Akt-mTORC1、Erk-MAPK和Smad通路，从而促进BMSCs和成骨前体细胞的增殖与分化。尽管BMP2信号在骨再生研究中备受关注，且重组人BMP2已在临床用于治疗骨缺损，但BMP2诱导成骨的详细分子机制尚未完全阐明。
Gαi蛋白家族包含Gαi1、Gαi2和Gαi3三种主要亚型，经典功能是经G蛋白偶联受体（GPCR）激活后抑制腺苷酸环化酶（AC），降低胞内cAMP水平。研究人员前期研究已证明Gαi1和Gαi3通过调控PI3K-Akt-mTOR及Erk通路，在多种受体酪氨酸激酶（RTK）信号（包括EGFR、BDNF受体TrkB和VEGF受体VEGFR2）中发挥关键介导作用。然而，BMP受体作为一类具有内在丝氨酸/苏氨酸激酶活性的独特受体家族，Gαi是否介导此类受体的信号转导尚属未知。本研究旨在探究Gαi1/3在骨形成及BMP2信号传导中的作用及其分子机制，为骨质疏松症和骨修复提供潜在治疗靶点。
**二、主要技术方法**
本研究综合运用多种关键技术手段：①利用公开的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（GSE150703）进行生物信息学分析，比较年轻（1.5月龄）和年老（16月龄）小鼠骨髓细胞转录组差异；②通过CRISPR-Cas9技术构建Gαi1/3双敲除（DKO）小鼠及Col1a1-Cre;Gαi1/3fl/fl条件性敲除小鼠，并结合micro-CT（μCT）扫描、组织学染色（H&E、Masson）、免疫荧光和钙黄绿素-茜素红双标记等分析骨量及骨形成参数；③利用Western blotting、免疫共沉淀（Co-IP）和原位邻位连接技术（PLA）检测蛋白磷酸化及蛋白间相互作用；④采用分子对接预测蛋白结合界面；⑤构建BMSCs基因敲低、敲除和过表达模型，结合碱性磷酸酶（ALP）和茜素红S染色评估成骨分化能力；⑥建立小鼠股骨骨折模型，通过AAV9介导的Runx2启动子驱动的Gαi1/3 shRNA实现BMSCs特异性敲低，评估骨折愈合效果。样本来源包括苏州大学附属第二医院伦理委员会批准的人体研究（老年及年轻骨折患者BMSCs）及苏州大学动物伦理委员会批准的动物实验。
**三、研究结果**
**3.1 Gαi1和Gαi3参与成骨功能与信号传导，且在衰老成骨细胞或BMSCs中表达降低**
通过分析1.5月龄和16月龄小鼠骨髓scRNA-seq数据，研究人员鉴定出16个细胞簇，发现年老小鼠骨髓中成骨细胞和软骨细胞数量显著减少而脂肪细胞增多。Gαi1/3在16月龄小鼠成骨细胞中表达显著降低，并在年老小鼠BMSCs中得到验证。功能富集分析显示与Gαi3共表达的基因富集于“骨化”、“成骨细胞分化”等成骨相关生物学过程，KEGG通路包括“TGF-β信号通路”和“PI3K-Akt信号通路”。老年骨质疏松患者BMSCs中Gαi1/3表达显著低于年轻个体，且成骨能力下降。Gαi1/3-DKO新生小鼠体型减小、生长迟缓，颅骨膜内成骨受损、锁骨缩短，成年后骨量降低，表现为骨小梁骨密度（BMD）、骨体积（BV）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和厚度（Tb.Th）下降而骨小梁分离度（Tb.Sp）增加，骨表面成骨细胞数量及Sp7阳性细胞减少，骨矿化沉积率（MAR）降低。
**3.2 Gαi1/3敲除阻断MEFs中BMP2诱导的Akt-mTOR、Erk和Smad信号激活**
在野生型（WT）小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中，BMP2处理剂量依赖性增强Akt、S6K、Erk1/2和Smad1/5磷酸化，而Gαi1/3-DKO MEFs中这些激活被完全消除。Gαi1或Gαi3单敲除（SKO）部分抑制BMP2诱导的信号激活，其中Gαi3 SKO的抑制效果强于Gαi1 SKO，而Gαi2 SKO无显著影响。在DKO MEFs中重新表达Gαi1或Gαi3可部分恢复BMP2诱导的信号激活，证实Gαi1/3对BMP2信号传导的必要性。
**3.3 Gαi1/3是MC3T3-E1细胞和BMSCs中BMP2诱导信号传导所必需的**
在MC3T3-E1成骨细胞中，siRNA介导的Gαi1/3单敲低或双敲低均抑制BMP2诱导的Akt、S6K、Erk1/2和Smad1/5磷酸化，shRNA稳定敲低几乎完全阻断信号激活。在BMSCs中，CRISPR/Cas9介导的Gαi1/3敲除显著减弱BMP2诱导的信号磷酸化，而过表达Gαi1/3则显著增强这些磷酸化事件，进一步证实Gαi1/3是BMP2信号的正向调节因子。
**3.4 Gαi1和Gαi3是BMP2介导成骨功能所必需的**
Gαi1/3敲低抑制BMSCs活性并阻断BMP2的促进作用，Runx2、Sp7和OPN蛋白及mRNA表达在Gαi1/3缺失时显著下调。Gαi1/3-DKO BMSCs的矿化能力降低，BMP2无法促进其矿化。敲低Gαi1/3后BMSCs成骨能力显著下降，而过表达则显著增强成骨能力。值得注意的是，Gαi1/3敲低几乎消除了BMP2的促成骨效应，而过表达则显著增强BMP2的成骨作用。在年老BMSCs中过表达Gαi1/3可恢复其成骨能力。
**3.5 Gαi1/3缺失抑制体内BMP2诱导的成骨**
通过AAV9-mRunx2-shRNA介导的BMSCs特异性Gαi1/3敲低（Gαi1/3-CKD）小鼠股骨骨折模型中，BMP2处理在Vehicle组几乎消除骨折间隙，而Gαi1/3-CKD组骨折间隙仍可见，骨痂BMD、骨痂体积（CV）和CV/TV显著降低。H&E和Masson染色显示Gαi1/3-CKD+BMP2组骨痂覆盖少、骨重塑缓慢，免疫组化显示OPN、Runx2和Sp7表达降低。此外，Col1a1-Cre;Gαi1/3fl/fl（GαiOB?）新生小鼠体型显著小于对照，颅骨和锁骨骨形成延迟，且存活困难。
**3.6 衔接蛋白Gab1作为Gαi1/3下游介导BMP2诱导的信号激活**
Gαi1/3-DKO阻断BMP2诱导的Gab1在Tyr-627位点的磷酸化，而Gαi2 SKO无显著影响。Gαi1/3-DKO MEFs中重新表达Gαi1或Gαi3可部分恢复Gab1激活，BMSCs中过表达Gαi1/3促进Gab1激活，敲低则显著降低。在Gab1敲除BMSCs中，BMP2诱导的Akt、S6K、Erk1/2和Smad1/5磷酸化被显著阻断。在Gαi1/3-DKO BMSCs中过表达Gab1不能恢复下游信号转导和成骨能力，表明Gab1作为Gαi1/3下游的关键衔接蛋白介导BMP2信号。
**3.7 Gαi1和Gαi3突变体破坏BMPR1A/B与衔接蛋白结合并阻止下游信号激活**
分子对接预测显示Gαi3与BMPR1A/B及Gab1之间存在氢键相互作用，Co-IP证实BMP2刺激后Gαi1/3与BMP2受体（BMPR2、BMPR1A/B）及Gab1结合，PLA实验证实内源性BMPR1A/B与Gab1的直接相互作用在Gαi1/3-DKO BMSCs中消失，重新表达Gαi1/3可恢复。显性负性（DN）突变体（G3盒保守Gly替换为Thr）破坏BMP2诱导的BMPR1A-Gab1结合，显著抑制Smad1/5、Akt和Erk1/2磷酸化及BMP2诱导的成骨。
**四、讨论与结论**
本研究揭示了Gαi1/3在老年骨质疏松症中表达异常降低，Gαi1/3-DKO小鼠骨骼发育延迟、骨量及骨质量下降。研究确证Gαi1/3是BMP2诱导Akt、Erk和Smad信号激活的关键介导因子，Gαi1/3缺失使细胞对BMP2的成骨效应无反应。在骨折模型中，Gαi1/3敲低延缓骨折愈合并消除BMP2的促愈合作用。机制上，Gαi1/3作为关键支架蛋白，桥接BMP2受体（BMPRI/II）与衔接蛋白Gab1，促进Gab1募集和激活，进而激活下游PI3K-Akt-mTOR、Erk和Smad通路。该发现将Gαi蛋白的功能谱从GPCR和RTK拓展至受体丝氨酸/苏氨酸激酶。研究结论指出，靶向Gαi1/3-Gab1轴是增强骨形成和治疗骨折及骨质疏松症等骨骼疾病的有前景的治疗策略。该研究为理解BMP2信号转导机制提供了新视角，并为骨再生医学和代谢性骨病的临床干预奠定了理论基础。论文发表于《Advanced Science》。
