可裂解连接子ADC中循环存在的半胱氨酸结合连接子-载荷代谢物及游离载荷的鉴定与定量策略

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Identification and quantitation strategies of circulating cysteine-conjugated linker-payload catabolites and free payload from a cleavable-linker ADC

　　•从可切割连接子ADC中检测并确认了循环存在的半胱氨酸结合型连接子-载荷代谢物（CLP），同时也检测到了游离载荷•这一发现挑战了“可切割连接子仅释放游离载荷”这一假设•对CLP进行了机制分析和正交质谱表征（原位裂解；线性与环化形式之间的转化）•针对CLP的线性形式提出了实用的生物分析解决方案：包括样品处理和稳定化处理（添加500 mM抗坏血酸）以避免分析误差•这一研究对暴露评估、药代动力学/药效学分析以及安全性监测具有直接意义，为CLP与游离载荷的常规监测提供了依据

引言
抗体药物偶联物（ADCs）作为一种高效且耐受性良好的化疗手段，通过单克隆抗体靶向肿瘤细胞表面过度表达的抗原[1]、[2]、[3]。这些抗体通过特殊的化学连接子与细胞毒性载荷相结合，从而实现高效治疗药物的精准递送，提升ADC的治疗效果[1]、[2]、[3]。ADC与目标抗原结合后，会被肿瘤细胞通过内吞作用摄取，进而释放载荷以摧毁目标细胞，同时降低全身性暴露风险[1]、[2]、[3]。ADC技术不断进步，逐渐成为抗癌治疗的重点。截至目前，已有数百种ADC制剂进入临床研发阶段，其中15种ADC获得了FDA批准，可用于治疗多种癌症。

尽管ADC在治疗效果方面取得了显著进展，但由于存在靶外毒性以及在可耐受剂量下疗效不足等问题，仍有改进空间[2]。这些问题导致许多ADC的临床研发被迫终止[2]。在大多数情况下，不良毒性是由于ADC的连接子-载荷化学结构所致，而非抗体或其靶标本身[4]、[5]。通过迈克尔加成反应形成的ADC可能会发生逆迈克尔解偶联反应，从而释放出少量含有马来酰亚胺的连接子-载荷，进而引发安全问题[6]。游离的含马来酰亚胺的连接子-载荷具有反应活性，容易被含硫亲核试剂捕获，通常是血清白蛋白上的半胱氨酸残基。ADC与白蛋白形成加合物后，会显著改变药物的分布、药代动力学特性以及毒性特征[7]、[8]、[9]。此外，硫代琥珀酰亚胺结构也可能与循环中的硫醇物质（如半胱氨酸、谷胱甘肽或白蛋白的游离硫醇）发生硫醇交换反应。这种反应的倾向性取决于抗体的连接位点[10]。

载荷的释放取决于连接子的化学性质。根据连接子-载荷结合体在细胞内的命运，ADC连接子可分为可切割型和不可切割型[1]、[2]、[3]、[11]、[12]。可切割型连接子包含易被酶（如β-葡萄糖醛酸酶、谷胱甘肽S-转移酶、组织蛋白酶）或在溶酶体（pH约4.8）和内体（pH约5.5–6.2）中由酸性环境引发的化学反应所切割的不稳定结构，肼类连接子就是这类连接的典型代表[11]。在这种情况下，ADC的疗效取决于游离载荷在肿瘤细胞内的释放情况。而不可切割型连接子的连接子-载荷结构较为稳定，其疗效则取决于ADC在细胞内的蛋白水解作用，该过程会产生仍保留有抗体氨基酸残基的连接子-载荷代谢物（即所谓的结合型连接子-载荷代谢物）[11]。可切割型连接子的ADC更容易在全身循环中提前释放载荷，从而导致靶外毒性[12]；不可切割型连接子的ADC在体内通常更为稳定，但疗效可能较差[1]、[11]、[12]。

准确测定血浆或血清中的游离及/或结合型连接子-载荷代谢物对于评估ADC的靶外毒性及整体安全性至关重要。究竟应测定游离载荷还是结合型连接子-载荷代谢物（如半胱氨酸加合物），并非易事，这需要深入理解ADC的代谢途径、连接子的稳定性以及切割机制。连接子的化学性质（可切割型与不可切割型）在很大程度上决定了生物分析的目标物。对于具有可切割型连接子（如基于肽类的连接子）的ADC，主要的生物分析分析物是游离载荷；而对于具有不可切割型连接子的ADC，主要的分析物则是结合型连接子-载荷代谢物（如半胱氨酸连接子-载荷代谢物，它可能存在线性或环化形式）。与传统的蛋白质疗法或小分子药物相比，载荷的生物分析面临更多挑战，因此，需要采用定制化的样品前处理方法、全面的稳定性评估以及优化的色谱和质谱分析流程，才能实现准确的定量分析。游离载荷及相关连接子-载荷代谢物在体内的浓度通常处于亚纳克/毫升级别，这就要求使用超灵敏的仪器和可靠的检测方法[13]、[14]。而研究样本中的ADC浓度往往要高得多（通常高3到6个数量级），这不仅增加了分析的复杂性，还可能带来干扰风险[13]、[14]。因此，必须确保在样品采集、处理或分析过程中，ADC的存在不会对载荷浓度的测定产生正向偏差，否则可能导致载荷浓度被高估[13]、[14]。还需要评估在ADC存在的情况下，载荷在血液、血浆或血清中的稳定性，以便为样品处理提供相应建议。此外，一些含有不稳定官能团（如内酯或酯类）的游离载荷分子极易发生内源性代谢或化学降解，从而生成新的分析物，给定量生物分析带来困难[14]、[15]、[16]。

本文描述了在针对一种含有可切割连接子的拓扑异构酶I抑制剂ADC-1的案例研究中，在游离载荷-1的生物分析以及CLP代谢物（线性及环化形式）的表征过程中所遇到的挑战及取得的经验教训。这项工作建立在之前的一项研究基础之上，那项研究开发了一种高度选择性的固相萃取法生物分析检测方法，用于在ADC-1给药后测定载荷-1的含量，为首次人体试验提供支持[14]。在审查临床样本数据时，发现在与载荷-1相同的选反应监测过渡峰处存在一个与药物相关的色谱峰；该峰的药代动力学特征与载荷-1相似，但在反相色谱柱上的洗脱时间更早，说明它是一种极性更高的分析物。由于该未知峰的强度与游离载荷-1相当，为满足监管要求，有必要对其结构进行阐明[17]、[18]。

从ADC候选物中识别并阐明CLP代谢物的结构是一项具有挑战性的任务，因为在临床样本中，其系统浓度通常仅为个位数纳克/毫升，而在最高剂量的临床前样本中，浓度也仅为两位数到三位数纳克/毫升，因此需要大量的样本量以及多级的浓度稀释步骤。连接子-载荷代谢物还具有复杂的结构，能够经历多种代谢转化[19]、[20]。为了同时检测极性和非极性代谢物，实验室通常采用有机溶剂进行非选择性蛋白质沉淀，然后再通过蒸发浓缩提取物。然而，当需要处理大量样本时，这种方法耗时较长，还可能促使不稳定的代谢物发生降解或转化，同时还会导致离子抑制以及严重的基质效应[8]、[19]-[21]。虽然更具选择性的技术（如液液萃取和固相萃取）可以减少基质效应，但需要大量的方法开发工作，而且可能会对一些意外出现的代谢物产生检测偏差[8]、[21]。高分辨率质谱虽能提供结构阐明所需的质量精度，但其灵敏度通常不足以在个位数纳克/毫升甚至更低浓度水平上可靠地检测代谢物[18]。因此，尽管存在基质效应，人们仍常用蛋白质沉淀结合蒸发浓缩的方法来提高检测灵敏度[8]、[19]-[21]。由于缺乏标准的参考物质，必须重新进行结构阐明工作[20]，而且还需要高度优化的色谱技术，才能将游离载荷与连接子-载荷代谢物区分开，避免出现分析误差[8]、[19]-[21]。因此，生物分析团队与生物转化/代谢物鉴定团队之间开展协作，充分利用三重四极杆质谱的灵敏度以及高分辨率质谱的结构阐明功能，对于实现准确的身份识别和特性分析至关重要[19]。本文介绍了一项协作成果，即发现了ADC-1的CLP代谢物（线性及环化形式），阐述了其对生物分析的意义，并提出了一种稳定化策略，以便在未来样本中准确测定游离载荷-1和CLP的含量。

章节摘录
化学品与试剂
载荷-1、马来酰亚胺己酰连接子载荷、其CLP的线性及环化形式以及ADC-1均为内部制备。二甲基亚砜、乙腈、甲酸、甲醇、乙醇、异丙醇、L-半胱氨酸、抗坏血酸以及碳酸氢铵均购自Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯市）。对照用人血清和食蟹猴血浆则购自BioIVT公司（美国纽约州韦斯特伯里市），并储存在-20°C条件下。

CLP线性及环化形式的合成
为制备线性形式的CLP，开展了两项平行反应。

临床研究中载荷-1的生物分析支持
ADC-1是由一种单克隆抗体通过一种高度特异性的、可被酶切割的、基于马来酰亚胺的四肽连接子与DNA拓扑异构酶I抑制剂载荷-1结合而成的。生物分析团队负责开发一种稳健且超灵敏的方法，用于在人血清中检测浓度范围为50-10,000皮克/毫升的游离载荷-1[14]。早期的临床生物分析工作采用了液液萃取结合三重四极杆质谱检测技术，同时还加入了用甲酸酸化血清的稳定化步骤。

结论
据我们所知，这是首篇报道并成功确定了一种来自可切割连接子ADC的循环存在CLP结构的文章，此前人们认为这类ADC仅能通过酶促或化学切割方式释放游离载荷。生物分析团队与生物转化团队之间的紧密合作，使得人们能够利用灵敏的分析平台及早检测到CLP，同时通过有针对性的样品前处理方法来鉴定代谢物，彼此分享关于化合物稳定性及色谱行为的见解，从而为后续研究指明了方向。

伦理行为声明
作者们确认，所有涉及人类受试者的研究都获得了相应的机构审查委员会批准。研究方案、知情同意书以及其他需要事先获得批准的文件，都已按照国际人用药品注册技术协调会的相关指南以及各国具体的法规要求，得到了机构审查委员会的审核与批准。所有参与者都签署了书面知情同意书。所有的动物实验都是按照GSK关于实验动物照料、福利及处理的政策来进行的。

CRediT作者贡献说明
Kevin Colizza：研究工作。Kasie Fang：研究工作。Hermes Licea-Perez：研究工作。

利益冲突声明
作者们声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢
作者们感谢Timothy Sikorski、Brennan Rose、Nicole Schneck、Huaping Tang、Eric Yang以及项目团队中的其他成员，他们为手稿的撰写提供了宝贵的意见和严谨的审阅。

财务与利益冲突披露
这项研究得到了GSK研究与开发部门的资助。所有作者均为GSK的员工，可能持有GSK的股票或有权获得GSK的股票期权。除此之外，作者们与任何其他组织或实体之间均不存在其他相关的隶属关系或财务利益关联。

Hermes Licea-Perez|Kasie Fang|Kevin Colizza