一种新型四氢姜黄素衍生物作为潜在抗结直肠癌药物：设计、合成及体外和体内生物学评价研究

《Natural Products and Bioprospecting》：A novel tetrahydrocurcumin derivative as a potential anti-colorectal cancer agent: studies on its design, synthesis, and in vitro and in vivo biological evaluation

　　

目的：本研究旨在设计并合成一系列含有α,β-不饱和羰基（α, β-unsaturated carbonyl）片段的四氢姜黄素（tetrahydrocurcumin, THC）衍生物，评估其抗癌活性，筛选用于结直肠癌（colorectal cancer, CRC）治疗的潜在候选分子，并评估其生物学活性。方法：研究人员通过Knoevenagel缩合反应高收率地合成了四氢姜黄素（THC）衍生物，并在HCT116、SW480、SW620、HeLa、A549和HepG2细胞系中评估了其抗癌活性。随后对目标化合物的体外和体内抗结直肠癌（anti-CRC）活性进行了研究。结果：大多数化合物对多种肿瘤细胞系表现出强大的抗增殖活性，且对结直肠癌（CRC）细胞具有显著增强的敏感性。氟化衍生物5（C5）相对于阳性对照5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）显示出更优的抗结直肠癌（anti-CRC）活性（IC₅₀ = 2.66 ± 0.82 μM）。相比之下，其还原产物化合物H5的效力下降了13倍（IC₅₀ = 35.74 ± 1.40 μM），验证了α,β-不饱和羰基片段是关键的药效团。此外，C5诱导HCT116细胞发生S期细胞周期阻滞，通过调节Bcl-2家族蛋白触发凋亡，并抑制细胞迁移。机制上，它通过下调p-AKT和p-mTOR抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路来发挥抗癌作用。在体内，C5在HCT116异种移植模型中有效抑制了肿瘤生长和癌细胞增殖，且疗效高于5-氟尿嘧啶（5-FU），毒性更低。结论：这些四氢姜黄素（THC）衍生物对结直肠癌（CRC）细胞表现出选择性靶向作用，并抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，在体外和体内均发挥显著抗结直肠癌（anti-CRC）功效，因此有望成为结直肠癌（CRC）治疗的潜在先导化合物。

# 论文解读：一种新型四氢姜黄素衍生物作为潜在抗结直肠癌药物的设计、合成及生物学评价

## 研究背景与意义

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是消化道常见的恶性肿瘤，根据2022年全球癌症统计数据，其发病率居所有恶性肿瘤第三位，死亡率居第二位，预计到2030年全球病例将增加60%。当前CRC的常规治疗包括手术、化疗、放疗和免疫治疗，但化疗耐药性和毒副作用严重限制了临床应用。因此，开发高效、低毒的新型抗CRC药物成为迫切需求。从天然产物及其活性代谢物中寻找先导化合物是药物发现的有效策略。姜黄素（curcumin, CUR）是传统中药姜黄等的主要活性成分，具有明确抗癌作用，但因化学不稳定性、低吸收、快速代谢和消除导致其系统生物利用度差。四氢姜黄素（tetrahydrocurcumin, THC）是姜黄素在体内的活性代谢物，与姜黄素相比具有更优的化学稳定性、生物利用度和体内抗肿瘤效果。研究表明，THC在氧化偶氮甲烷（azoxymethane, AOM）诱导的小鼠CRC模型中减少异常隐窝灶（aberrant crypt foci, ACF），且比姜黄素更有效抑制结直肠肿瘤发展；在裸鼠异种移植模型中，THC对HepG2肝癌和CaSki宫颈癌具有更强的抗血管生成和抗转移作用；还能通过降低谷胱甘肽（glutathione, GSH）水平抑制胶质瘤生长，并在骨肉瘤肺转移模型中减少转移结节。这些发现表明THC具有优于姜黄素的体内生物学效应。近年来，在天然产物结构修饰中引入Michael受体（Michael acceptor）是优化和改善生物活性的有效策略。α,β-不饱和羰基（α, β-unsaturated carbonyl）是常见的Michael受体，可与细胞蛋白中的多种硫醇反应，产生一系列生物活性。例如，含有α,β-不饱和羰基的18β-甘草次酸衍生物对HCT116细胞具有强抗增殖活性（IC₅₀ = 0.14 ± 0.02 μM）；在穿心莲内酯A环引入α,β-不饱和羰基后显著增强了对HCT116细胞的生长抑制。本研究旨在通过引入α,β-不饱和羰基对THC进行结构修饰，以增强其抗癌活性，并研究合成化合物对不同癌细胞的 selectivity 和构效关系，评估其体内外抗癌效果及潜在机制。该论文发表在《Natural Products and Bioprospecting》。

## 主要关键技术方法

研究人员采用的关键技术方法包括：通过Knoevenagel缩合反应，以哌啶和乙酸为催化剂，THC的活泼亚甲基与各种取代芳香醛反应，脱水生成含有α,β-不饱和羰基的THC衍生物C1–C18；对化合物C5进行催化加氢还原得到H5。采用MTT法在HCT116、SW480、SW620、HeLa、A549、HepG2及正常肠上皮NCM460细胞系中评估化合物的抗增殖活性和选择性，细胞系均来自南方医科大学癌症研究所。利用流式细胞术分析细胞周期和凋亡，采用划痕实验评估细胞迁移，通过Western blot检测凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax）及PI3K/AKT/mTOR通路蛋白（AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR）。在昆明小鼠中进行急性毒性实验确定安全剂量范围，在BALB/c裸鼠HCT116异种移植模型中评估体内抗肿瘤活性，并通过免疫组化（Ki-67）、H&E染色和TUNEL荧光染色分析肿瘤组织。

## 研究结果

### 2.1 化学合成
通过Knoevenagel缩合反应成功合成了C1–C18共18个THC衍生物，并将C5还原得到H5，所有目标化合物结构经¹H NMR、¹³C NMR和HRMS表征。

### 2.2 生物学活性

#### 2.2.1 体外抗增殖活性
通过MTT法检测C1–C18对HCT116、HeLa、A549、HepG2四种肿瘤细胞系的抗增殖活性，以顺铂为阳性对照。结果显示，除C14外，几乎所有化合物对四种癌细胞系的抗增殖活性均强于母体THC，其中对HCT116细胞活性最强。在HCT116细胞中，所有化合物活性均优于THC，含有羟基、甲氧基和卤素吸电子基团的化合物C1、C2、C3、C5、C6、C7、C13活性显著优于顺铂（p < 0.05），其中C5（IC₅₀ = 2.66 ± 0.82 μM）活性约为THC的20倍，顺铂的5倍。进一步对三种结直肠癌细胞系（HCT116、SW480、SW620）测试，化合物在引入α,β-不饱和羰基后对CRC细胞增殖抑制活性显著提升，约为THC的1.4–40倍，约50–60%化合物活性至少是THC的10倍，表明该类化合物对CRC细胞具有选择性。构效关系分析表明，吸电子基团（如卤素）通常比给电子基团增强活性；在芳香杂环系统中，给电子效应（如吡啶、苯并噻吩、噻吩）的化合物活性优于吸电子五元杂环。通过对比C5与还原产物H5的活性，C5的IC₅₀为2.66 ± 0.82 μM，H5的IC₅₀为35.74 ± 1.40 μM（p < 0.05），活性降低约13倍，验证了α,β-不饱和羰基是重要的药效团，主要通过与含硫醇蛋白的共价相互作用发挥效应。对正常肠上皮细胞NCM460的毒性测试显示，除C14外，所有修饰后化合物的选择性指数（selectivity index, SI）均高于THC且大于1，其中C5对HCT116细胞的SI值达10.09，约为5-FU（SI=4.83）的两倍，表明C5兼具强抗CRC活性和低正常细胞毒性，因此被选为后续研究化合物。

#### 2.2.2 C5抑制HCT116细胞的克隆增殖
通过集落形成实验，C5处理HCT116细胞48 h后，集落数量随浓度增加显著减少。在9 μM浓度下，集落形成几乎完全抑制（集落数88.22 ± 2.85），优于阳性对照5-FU（12 μM，集落数108.30 ± 5.21）。

#### 2.2.3 C5诱导HCT116细胞S期阻滞
流式细胞术分析显示，C5处理HCT116细胞48 h后，S期细胞比例从对照组的22.85%剂量依赖性增加至24.83%（3 μM）、46.23%（6 μM）和56.98%（9 μM），高浓度组（9 μM）的S期阻滞效果与5-FU（12 μM，55.25%）相当，表明C5可能引起DNA损伤，诱导S期细胞周期阻滞。

#### 2.2.4 C5诱导HCT116细胞凋亡
Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术结果显示，C5处理48 h后，总凋亡细胞比例从对照组的6.68%显著增加至22.14%（3 μM）、33.21%（6 μM）和76.92%（9 μM），高浓度组（9 μM）诱导凋亡效果显著优于5-FU（12 μM，27.04%）（p < 0.001），且C5主要诱导晚期凋亡（占总凋亡85%）。Western blot检测表明，C5剂量依赖性下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，上调促凋亡蛋白Bax表达，提示C5可能通过调节Bcl-2家族蛋白激活caspase依赖性内源性凋亡通路。

#### 2.2.5 C5抑制HCT116细胞迁移
划痕实验显示，C5处理48 h后，细胞愈合率从对照组的78.81%剂量依赖性降低至64.46%（3 μM）、60.76%（6 μM）和37.94%（9 μM），其中9 μM组愈合率显著低于5-FU（12 μM，59.30%）（p < 0.01），表明C5浓度依赖性抑制HCT116细胞迁移。

#### 2.2.6 C5体内急性毒性实验
在昆明小鼠中进行急性毒性实验，单次腹腔注射C5（50、100、200、500、1000 mg/kg），连续观察14天。50和100 mg/kg组无异常临床症状或死亡，≥200 mg/kg出现明显毒性反应和死亡。根据改良Karber法计算C5的半数致死剂量（LD₅₀）为354.81 mg/kg，95%置信区间263.41–477.93 mg/kg，最大耐受剂量（MTD）为100 mg/kg。根据临床前抗肿瘤候选药物常规剂量设计原则，选择25、50、75 mg/kg作为体内抗CRC研究的三个剂量水平。

#### 2.2.7 C5体内抗肿瘤活性
在BALB/c裸鼠HCT116异种移植模型中，C5（25、50、75 mg/kg）腹腔注射，每两天一次，共21天。结果显示，C5各剂量组肿瘤体积增长缓慢，呈剂量依赖性，高剂量组（75 mg/kg）肿瘤体积为185.40 ± 99.93 mm³，优于阳性对照5-FU组（25 mg/kg，200.50 ± 80.29 mm³）。肿瘤生长抑制率分别为30.76%（25 mg/kg）、66.28%（50 mg/kg）和85.12%（75 mg/kg），5-FU组为77.15%。摩尔剂量换算分析表明，C5（75 mg/kg）的摩尔剂量仅为5-FU（25 mg/kg）的81.59%，但抑制率更高，证实C5体内抗CRC疗效显著优于5-FU。免疫组化分析显示，C5组肿瘤组织中Ki-67阳性细胞显著减少，且效果强于5-FU；H&E染色显示C5组肿瘤细胞间隙疏松，核固缩和坏死改变更严重；TUNEL荧光染色显示C5诱导肿瘤细胞凋亡增加。组织学分析显示，5-FU引起肝细胞坏死和严重肝损伤，C5在中高剂量下也引起一定肝损伤但程度较轻，表明C5毒性低于5-FU。

#### 2.2.8 C5对PI3K/Akt/mTOR信号通路的抑制作用
通过SwissTargetPrediction数据库和KEGG富集分析预测C5的潜在靶点和信号通路，结果显示C5有102个预测靶点（P > 0.1），影响89条KEGG通路（P < 0.05），其中PI3K/Akt/mTOR通路被鉴定为潜在受影响通路之一。Western blot结果显示，C5处理HCT116细胞48 h后，显著降低p-AKT和p-mTOR蛋白表达，且p-AKT/AKT比值和p-mTOR/mTOR比值呈浓度依赖性显著下降。因此，C5可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，抑制细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。

## 总结与讨论

本研究设计并合成了一系列含有α,β-不饱和羰基的THC衍生物，以增强其与生物硫醇的Michael共价加成作用，从而提高抗肿瘤活性。通过评估化合物对多种肿瘤细胞系的抗增殖活性，发现大多数化合物活性优于THC，尤其对结直肠癌细胞表现出选择性。构效关系研究表明，吸电子基团显著增强活性，可能归因于Michael受体亲电性增加。化合物C5（对位氟代芳香衍生物）对HCT116细胞的IC₅₀为2.66 ± 0.82 μM，优于阳性对照5-FU。当C5的双键被还原后，活性显著降低，证实α,β-不饱和羰基是该系列衍生物抗CRC活性的重要药效团。体内实验表明，C5显著抑制裸鼠HCT116异种移植瘤的增殖和生长，效果与一线药物5-FU相当。机制研究显示，C5通过抑制HCT116细胞中p-AKT和p-mTOR的表达，进而抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡。尽管C5毒性显著低于5-FU，但高剂量组仍引起一定肝损伤。因此，未来研究将聚焦于C5的结构优化，以改善其ADME/T性质，获得具有类药性的抗CRC候选药物。结论部分：总之，我们合成了一系列含有α,β-不饱和羰基的THC衍生物，以增加它们与生物硫醇的Michael共价加成作用，从而增强抗肿瘤活性。我们评估了这些化合物对HCT116、SW480、SW620、Hela、A549和HepG2细胞系的抗增殖活性。有趣的是，大多数化合物表现出比THC更强的抗增殖活性，特别是对结直肠癌细胞。构效关系研究还表明，具有吸电子基团的化合物表现出显著优于给电子基团的抗增殖活性，且具有吸电子基团的化合物表现出显著更优的抗结直肠癌细胞增殖活性，可能归因于Michael受体亲电性增加。化合物C5，一种对位氟代芳香衍生物，对HCT116细胞的IC₅₀值为2.66 ± 0.82 μM，优于阳性对照药物5-FU。当C5的双键被还原后，所得化合物H5的抗增殖活性显著降低，表明α,β-不饱和羰基是该系列衍生物抗结直肠癌活性的重要药效团。体内实验表明，C5显著抑制荷瘤裸鼠中HCT116的肿瘤增殖和生长，其效果与抗CRC一线药物5-FU相当。进一步的机制研究表明，C5抑制HCT116细胞中p-AKT和p-mTOR的表达，从而抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路以诱导肿瘤细胞凋亡，表明C5可能是一种有前景的抗结直肠癌药物先导化合物。尽管C5毒性显著低于5-FU，但高剂量组仍引起一定肝损伤。因此，我们未来的工作将聚焦于C5的结构优化，以改善其ADME/T性质，并获得具有类药性的抗结直肠癌候选药物。