吴茱萸碱A-G：从吴茱萸果实中分离得到的七个新生物碱及其抗真菌活性

《Natural Products and Bioprospecting》：Wuchuyuamines A-G, seven new alkaloids isolated from the fruits of Tetradium ruticarpum and their antifungal activities

　　

由真菌病原体引起的植物病害严重威胁作物产量和粮食安全，亟需开发新型环保杀菌剂。本研究从吴茱萸（*Tetradium ruticarpum*）果实中分离得到36个生物碱，包括7个新化合物（1–4, 23, 29, 30），并通过广泛的光谱分析阐明了其结构。采用菌丝生长速率法，评估了获得量充足的化合物对三种植物病原真菌（*Alternaria solani*、*Bipolaris sorokiniana*和*Fusarium odoratissimum*）的抗真菌潜力。化合物16和24对*A. solani*表现出显著活性，在100 μg/mL浓度下分别抑制约80%和90%的生长，IC₅₀值分别为33.39和36.02 μg/mL。为评估抗真菌谱，进一步测定了含量丰富的成分13、19和25对16种植物病原真菌的活性。其中，化合物25表现出最强且广谱的抗真菌活性，对禾谷镰刀菌（*Fusarium graminearum*）的IC₅₀为13.15 μg/mL，强于阳性对照恶霉灵（hymexazol）。此外，扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）分析表明，化合物25显著破坏表面形态和细胞超微结构，提示其可能与膜完整性损伤相关。泄漏实验显示核酸和蛋白质释放增加，证明化合物25增强了禾谷镰刀菌的膜通透性并损害了膜完整性。因此，化合物25是开发新型环保杀菌剂的有前景的先导结构。

**论文解读：吴茱萸果实中新型生物碱的发现及其抗真菌活性研究**

**一、研究背景与意义**

真菌性植物病害对全球农作物产量和粮食安全构成严重威胁，已知约8000种真菌和卵菌与植物病害相关，其中稻瘟病菌（*Magnaporthe oryzae*）、灰葡萄孢（*Botrytis cinerea*）、柄锈菌属（*Puccinia* spp.）、禾谷镰刀菌（*Fusarium graminearum*）和尖孢镰刀菌（*Fusarium oxysporum*）等是科学和经济上最重要的病原真菌。化学防治仍是管理植物病害最广泛使用的方法，但合成杀菌剂的过度和长期使用已导致环境污染、对人类和动物的潜在健康风险以及病原菌抗药性出现等问题，因此迫切需要更安全、可持续的替代方案。植物源天然产物作为杀菌剂来源的开发符合面向未来的农业政策。生物碱作为一类含氮杂环化合物，因其相对较低的哺乳动物毒性、易生物降解性和环境相容性而受到越来越多的关注。吴茱萸（*Tetradium ruticarpum*）是芸香科（Rutaceae）吴茱萸属植物，作为传统中药“吴茱萸”已使用数百年，用于治疗头痛、腹痛和呕吐等疾病。植物化学研究已表明吴茱萸含有多种生物活性成分，包括生物碱、柠檬苦素类（limonoids）和黄酮类，迄今已报道约300种代谢物，其中约一半为生物碱。然而，吴茱萸来源生物碱的抗真菌潜力在很大程度上尚未被探索。本研究旨在系统分离鉴定吴茱萸果实中的生物碱，并评估其对植物病原真菌的抗真菌活性，为开发新型环保杀菌剂提供先导化合物。

**二、主要技术方法概述**

研究人员从吴茱萸果实（购自重庆中苗医药有限公司，2023年9月，批号230201，由中国科学院昆明植物研究所向春雷博士鉴定，凭证标本号KIBH20230915）中，采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20、RP-18反相柱色谱及高效液相色谱（HPLC）等技术系统分离得到36个生物碱。结构鉴定综合运用高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）、一维和二维核磁共振谱（包括¹H NMR、¹³C NMR、DEPT、HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY）、紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、圆二色谱（ECD）和旋光度测定等方法。抗真菌活性采用菌丝生长速率法，对多个植物病原真菌进行筛选，并通过扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察菌丝形态和超微结构变化，同时通过测定260 nm和280 nm吸光度评估细胞内容物（核酸和蛋白质）泄漏情况。所有实验均设三次独立生物学重复，IC₅₀值通过非线性回归计算。

**三、研究结果**

**3.1 结构鉴定与识别**

从吴茱萸果实中分离得到36个生物碱，其中7个为新化合物，命名为吴茱萸碱A-G（wuchuyuamines A-G，化合物1–4、23、29、30）。通过HRESIMS确定分子式，结合NMR数据分析阐明结构。化合物1为C-裂环吲哚喹唑啉生物碱，C-5位连有羟基。化合物2的¹H NMR信号显著增宽，经盐酸-甲醇衍生化后信号变锐，结构为含吲哚酮单元的化合物，且为外消旋混合物。化合物3与10-甲氧基吴茱萸酰胺II（10-methoxygoshuyuamide-II）结构相似，但C-3位为亚甲基而非羰基。化合物4为C环断裂的吲哚喹唑啉生物碱，C-5与N-4键断裂且C-5连有羟基，亦为外消旋体。化合物23为含长链脂肪烃的N-甲基-4(1H)-喹诺酮类生物碱，侧链含三个E式双键。化合物29和30为色胺衍生物，其中30比29多一个甲酰基。此外，化合物8、15、22和34为首次从吴茱萸中报道。

**3.2 体外抗真菌活性**

对含量充足的化合物（2、4、12–14、16、18、19、24–26、31、33）进行抗真菌活性筛选，针对三种植物病原真菌（*A. solani*、*B. sorokiniana*和*F. odoratissimum*）。结果显示，化合物16和24对*A. solani*表现出显著抑制活性，在100 μg/mL浓度下抑制率分别接近80%和90%，IC₅₀分别为33.39和36.02 μg/mL，呈剂量依赖性抑制，但略低于阳性对照恶霉灵。进一步对含量丰富的成分13、19和25进行广谱抗真菌评价，针对16种植物病原真菌（包括*Botrytis* sp.、*Ceratocystis fimbriata*、*Colletotrichum capsici* f. *nicotianae*、*Curvularia lunata*、*Exserohilum turcicum*、*F. graminearum*、*Fusarium moniliforme*、*F. oxysporum*、*Gerlachia nivalis*、*Neofusicoccum* sp.、*Pestalotiopsis maculans*、*Phytophthora capsici*、*Rhizoctonia solani*、*Verticillium dahliae*等）。其中化合物25表现出最强的抗真菌活性，抑制率在7.2%至83.5%之间，尤其对禾谷镰刀菌的抑制活性优于恶霉灵，IC₅₀为13.15 μg/mL。化合物13表现出中等抑制活性，最大抑制率在100 μg/mL时为72.9%。化合物19对所有测试真菌均显示可忽略的抑制活性。

**3.3 对禾谷镰刀菌形态和超微结构的影响**

利用SEM观察发现，经15 μg/mL化合物25处理后，禾谷镰刀菌菌丝出现生长紊乱、扭曲、表面粗糙、局部塌陷和菌丝断裂，而DMSO对照菌丝细长、均匀且光滑。TEM观察进一步显示，处理后菌丝细胞壁轮廓变形，质膜模糊不清，细胞质明显空泡化，液泡膜显著皱缩，部分线粒体结构紊乱且膜完整性受损。这些结果表明化合物25严重破坏了禾谷镰刀菌的细胞超微结构。

**3.4 对禾谷镰刀菌细胞质内容物泄漏的影响**

通过测定菌丝上清液在260 nm和280 nm处的吸光度，评估核酸和蛋白质泄漏。DMSO对照组OD_{260 nm}和OD_{280 nm}值随时间保持稳定，而经15 μg/mL化合物25处理后，两种吸光度值在4小时内呈时间依赖性增加，表明化合物25增强了细胞膜通透性，导致膜破裂和胞内物质泄漏。

**四、讨论与结论**

本研究从吴茱萸果实中系统分离并鉴定了36个生物碱，包括7个新化合物，丰富了吴茱萸生物碱的化学多样性。抗真菌活性评估显示，喹诺酮类生物碱化合物25具有广谱且强效的抗真菌活性，特别是对禾谷镰刀菌的抑制效果优于商品化杀菌剂恶霉灵。SEM和TEM观察及内容物泄漏实验证实，化合物25通过破坏细胞膜完整性发挥抗真菌作用，导致代谢紊乱和细胞死亡。这些发现不仅扩展了吴茱萸生物碱的结构类型，也凸显了喹诺酮类生物碱作为开发新型、高效、环境友好型杀菌剂的潜在先导结构。研究结论为：从吴茱萸果实中分离鉴定了36个生物碱，包括7个新化合物；化合物16和24对*A. solani*具有中等抑制活性；化合物25对禾谷镰刀菌表现出显著广谱抗真菌效果，其效力超过恶霉灵；化合物25通过破坏菌丝表面形态和细胞超微结构、诱导胞内物质泄漏导致细胞死亡，是开发新型环保杀菌剂的有前景的先导化合物。