关于硫酸盐与苯、甲苯、乙苯协同修复机制的深入研究：环境限制因素、生物刺激效果及作用机理

《Journal of Water Process Engineering》：Insights into the enhanced synergistic remediation of sulfate and benzene, toluene, and ethylbenzene: Environmental constraints, biostimulation performance, and underlying mechanisms

　　•经过富集的SRB菌群表现出较强的环境适应性。•该SRB菌群能够利用苯、甲苯和乙苯进行硫酸盐还原反应。•该菌群能依次降解甲苯、乙苯和苯。•乳酸钠可提升硫酸盐还原及苯的降解速率。•乳酸钠还能上调参与苯和硫酸盐去除的酶及基因表达。

引言
工业、农业及其他人类活动日益加剧，不断向土壤和地下水系统排放大量硫酸盐，导致硫酸盐污染问题愈发严重。主要人为污染源包括含硫工业废水与气体排放、农业中大量使用含硫肥料，以及采矿活动引发的硫化物矿物暴露和氧化[1]。此外，用于处理高浓度有机污染物的活化过硫酸盐技术也会向土壤和地下水中引入大量硫酸盐[2]。据估计，人为活动导致的硫酸盐输入占这些系统中硫酸盐总量的50–80%，全球约10%地区的地下水硫酸盐浓度超过250毫克/升[1]、[3]、[4]。过高的硫酸盐浓度会导致土壤酸化，削弱土壤结构稳定性与养分保持能力，腐蚀基础设施，还会促进砷的释放，从而损害生态系统；摄入受硫酸盐污染的水还可能引发胃肠道疾病和神经系统损伤[5]、[6]、[7]。然而，针对土壤和地下水高硫酸盐污染的有效且可行的修复方法仍然有限。在工程实践中，通常需要将地下水抽取到地面，通过吸附、沉淀等工艺去除硫酸盐，但这些方法存在诸如产生废渣、成本高昂以及产生大量二次废弃物等问题[8]。诸如垂直屏障墙之类的物理隔离措施虽可部分限制污染物迁移，但由于硫酸盐具有强腐蚀性和高流动性，难以实现长期稳定控制[9]。另外，虽然利用耐盐植物和人工湿地进行植物修复可以降低硫酸盐浓度，但这些方法通常效率较低，且处理效果易受环境条件影响[10]。在此背景下，微生物修复因其成本效益高、可在原位应用且环境相容性好而受到越来越多关注。它能在低能量原位条件下保持功效，且非常适合地下水系统缓慢且相对稳定的水文地球化学特征[11]、[12]。因此，微生物修复在修复受硫酸盐污染的场地方面具有巨大潜力。

硫酸盐还原菌是一类广泛分布于各种自然和人为环境中的厌氧或兼性厌氧原核生物。它们在硫循环中起着关键作用，以硫酸盐作为最终电子受体来驱动能量代谢。SRB通常具有很强的环境适应能力以及出色的原位生长潜力[13]。从代谢方式来看，根据其营养策略，SRB可分为自养型或异养型；根据底物氧化程度，则可分为完全氧化菌或不完全氧化菌[14]、[15]。在代谢途径方面，SRB拥有独特的双重模式硫酸盐还原系统：其一为同化硫酸盐还原途径，可通过该途径将硫酸盐转化为含硫生物分子；其二为异化硫酸盐还原途径，在此过程中，硫酸盐首先被活化为腺苷5′-磷酸硫酸盐，随后再通过APS还原酶和亚硫酸盐还原酶的作用被还原为硫化物[16]。总体而言，SRB的系统发育多样性及其代谢多功能性使其能够在多种环境条件下保持活性，这凸显了其在生物修复方面的应用潜力。尽管具备如此潜力，现有研究大多集中在矿山废水处理、重金属固定以及微生物引起的腐蚀方面，而针对复杂污染场地的实际修复研究则相对较少。因此，有必要进一步研究SRB相关策略在这些特定场景下的可行性与效果[12]、[17]。此外，土壤和地下水的复杂地球化学条件会显著影响SRB的生长与代谢。污染场地的pH值、温度、盐度等相关参数的变化可能会改变电子供体与受体的生物有效性，影响硫酸盐还原速率，并进而影响微生物群落的稳定性[18]。在这种背景下，微生物群落往往比单一菌株表现更好，因为它们通常具有更强的环境适应能力和协同降解能力，能在压力条件下实现更高效的修复效果[19]。因此，有必要富集合适的SRB菌群，并系统评估其在不同环境梯度下的功能阈值，从而确定其在污染场地修复中的最佳应用条件。

与此同时，虽然各种工业和农业活动会向土壤和地下水引入硫酸盐污染，但它们也会带来大量的有机污染物，从而导致共污染现象[1]、[20]。苯、甲苯和乙苯是这类系统中典型的石油烃类污染物。由于这些化合物具有致癌、致畸和致突变作用，加之其高水溶性和高流动性，已被包括美国和中国在内的许多国家列为优先控制污染物。它们对生态系统健康和地下水安全构成持续威胁[21]、[22]、[23]。苯、甲苯、乙苯与硫酸盐的共污染会带来复杂的环境行为和更高的生态风险，使得修复工作比单一污染物污染的情况更为困难，也对现有的修复技术提出了更高要求[24]。值得注意的是，某些SRB能够转化有机污染物——例如，Desulfotomaculum可以利用某些短链有机化合物或简单芳香族化合物作为电子供体[25]。因此，通过SRB同时实现苯、甲苯和乙苯的降解与硫酸盐的还原，是一种极具前景的修复策略。初步研究已探讨了SRB对苯、甲苯或乙苯单独降解的作用。例如，Hsia等人[26]发现Desulfovibrio具有去除甲苯和甲基叔丁基醚的能力，而Liu等人[27]和Huang等人[28]则表明，适当强化硫酸盐还原作用可提高甲苯和苯的去除效率。然而，人们往往忽视硫酸盐浓度的动态变化，当多种苯、甲苯、乙苯化合物与硫酸盐共存时，SRB菌群的优先降解顺序、潜在的协同去除效应以及其对碳源的偏好程度仍需进一步明确。

异养型SRB通常比自养型SRB更快地还原硫酸盐，但需要充足的有机底物；从化学计量角度来说，理论上1克硫酸盐的还原需要0.67克化学需氧量，而地下水中的有机碳含量通常较低，这限制了硫酸盐还原的持续性和稳定性[29]、[30]。通过添加外源营养物质或电子供体进行生物刺激，可加速SRB的定殖并激活其代谢潜能，从而缓解这一限制[31]。在苯、甲苯和乙苯化合物中，苯由于其对称且稳定的结构而相对较难降解；厌氧条件下的降解通常通过甲基化、羟基化或羧基化反应进行，最终形成苯甲酰辅酶A，而苯甲酰辅酶A还原酶对苯甲酰辅酶A的还原是实现环结构脱芳构化及后续分解的关键限速步骤[25]。添加碳源可促进难降解有机物的共代谢转化，从而在一定程度上加速苯的降解[32]。不过，不同SRB属对碳源的偏好各不相同，Desulfovibrio更倾向于乳酸，而Desulfosporosinus和Desulfotomaculum则更喜欢碳水化合物[33]、[34]。因此，对于SRB菌群而言，需同时考虑碳源类型和用量，以便在降低成本的同时，增强硫酸盐还原以及苯、甲苯、乙苯降解的协同效应。除了这里研究的单芳香族化合物外，基于SRB的生物刺激方法也可能适用于受氯化脂肪族化合物污染的地下水，不过这一可能性还需通过实验直接验证。

基于以上考虑，本研究首先富集了一株具有较强环境耐受性的SRB菌群，并评估了其环境适应性。随后选取苯、甲苯和乙苯，以检测该菌群对这三种单芳香族化合物的耐受性与降解能力。接着在含有多种单芳香族化合物和硫酸盐的共污染系统中，进一步研究了其优先降解顺序。最后以苯为模型化合物，探讨了生物刺激对苯和硫酸盐同步去除的影响，并通过分析酶活性、基因丰度以及微生物群落构成的变化，研究了其背后的作用机制。

SRB菌群富集过程
研究从一处存在硫酸盐和有机污染记录的废弃化工场所，于0.5–1.0米深度处采集土壤。关于采样地点及接种土壤的详细信息见表S1。本研究采用改良的Postgate培养基作为SRB富集培养基[35]，该培养基的成分及浓度如下（克/升）：KH2PO4，0.1；K2HPO4，0.5；NH4Cl，1.0；Na2SO4，1.0；MgSO4·7H2O，0.1；CaCl2·2H2O，0.1；乳酸钠，4.0；酵母提取物，1.0；FeSO4·7H2O，1.0。

环境因素的影响
温度对SRB菌群的物理化学环境及代谢活性均有显著影响。虽然pH值保持稳定，但低温会导致氧化还原电位升高，而菌体生物量则随温度上升而增加，最高可达108个细胞/毫升（见图S1）。硫酸盐还原效率也与温度呈正相关关系（见图1a）：在10℃、20℃和30℃条件下，第20天的硫酸盐还原率分别为16.24±0.58%、52.66±0.54%和75.26±0.63%。

讨论
该SRB菌群表现出很强的环境适应性。在本研究中，该菌群在pH值范围为5–9、温度范围为10–30℃以及高盐度条件（硫酸盐浓度5000毫克/升，氯化物浓度10000毫克/升）下仍能保持活性，这说明它能够在所测试的各种环境梯度下持续发挥作用（见图1）。通常情况下，地下环境中的硫酸盐浓度多在0.2至30毫摩尔/升（19.2–2880毫克/升）之间[31]。该SRB菌群具备……

结论
本研究在受控的实验室批量条件下，评估了经富集的SRB菌群的环境适应能力及修复性能。在该菌群存在的情况下，当苯、甲苯和乙苯的浓度低于200毫克/升时仍能保持活性，而浓度达到500毫克/升时则会出现抑制作用。与相应的非生物对照组相比，添加SRB后，苯、甲苯和乙苯的去除效率有所提高，同时还伴随着硫酸盐的还原作用。在混合……

CRediT作者贡献声明
Yong Chen：撰写——初稿、方法学、概念设计。Jun Gu：撰写——审阅与编辑、概念设计。Yong Wang：撰写——审阅与编辑。Manjun Zhan：撰写——审阅与编辑。Ran Yu：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、概念设计。

利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划的支持（项目编号2023YFC3709600）。

Yong Chen|Jun Gu|Yong Wang|Manjun Zhan|Ran Yu