MiR-485-5p通过激活VEGFR-2/AKT/ERK1/2信号通路，靶向RGS4以促进下肢缺血区域的血管生成

《Life Sciences》：MiR-485-5p targets RGS4 to promote angiogenesis in lower limb ischemia by activating VEGFR-2/AKT/ERK1/2 signaling

　　摘要：血管生成对缺血后组织修复至关重要。尽管miR-485-5p在血管组织中高表达，且RGS4可调控血管生成，但它们在缺氧环境中的具体作用仍不明确。本研究旨在阐明这些功能及其背后的机制。我们在HUVECs中构建了CoCl?诱导的缺氧模型，发现缺氧会显著降低miR-485-5p的表达，同时提高RGS4 mRNA的水平。值得注意的是，抑制RGS4或过表达miR-485-5p都能显著促进HUVECs的增殖、迁移和管状结构形成。荧光素酶报告基因实验进一步证实miR-485-5p可直接靶向RGS4。此外，miR-485-5p过表达或RGS4抑制还会增加VEGFR-2、AKT和ERK1/2的磷酸化水平。通过共免疫沉淀实验，我们首次发现了RGS4与VEGFR-2之间的直接相互作用，这种相互作用会抑制VEGF信号传导，从而阻碍血管生成。相反，RGS4过表达则能逆转miR-485-5p的促血管生成效应，表现为HUVECs的VEGFR-2/AKT/ERK1/2磷酸化水平下降，增殖、迁移及管状结构形成能力减弱。这些研究结果表明，miR-485-5p通过降低RGS4的表达来促进血管生成。与体外实验结果一致，利用大鼠下肢缺血模型进行的体内实验也表明，通过si-RGS4抑制RGS4或通过agomir-miR-485-5p过表达miR-485-5p，都能显著改善血液灌注恢复情况，促进血管生成，并提升VEGFR-2/AKT/ERK1/2的磷酸化水平。总体而言，我们的研究表明，miR-485-5p/RGS4轴通过解除RGS4对VEGFR-2/AKT/ERK1/2信号通路的抑制作用，从而促进缺氧诱导的血管生成，这为将miR-485-5p作为治疗下肢动脉疾病的目标提供了有力依据。

引言：外周动脉疾病（PAD）的全球患病率和发病率不断上升，使得患者发生系统性心血管事件和死亡的风险显著增加[1]。目前的血运重建策略在缓解患有弥漫性微血管疾病的患者的远端组织缺血方面效果不佳[2]。因此，基于血管生成的治疗方式已成为改善缺血性疾病临床结局的重要手段。缺氧是促进血管生成的主要生理刺激，而血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）信号通路则是驱动缺氧诱导血管生成的核心机制[3][4][5]。AKT和ERK1/2是VEGFR-2的关键下游效应分子，它们能够调节内皮细胞功能并参与血管生成过程[3][6]。虽然血管内皮生长因子（VEGF）在体外和动物模型中被证实是一种有效的血管生成因子，但在临床试验中，单纯的VEGF基因或蛋白疗法未能持续显著改善患者的临床预后[3][7][8]。这凸显出亟需寻找新的治疗靶点，以解决下肢缺血后血管生成效果不佳的问题。G蛋白信号调节子4（RGS4）属于RGS超家族的重要成员，可作为G蛋白偶联受体（GPCRs）的负调控因子[9][10]。最新研究显示，RGS4可通过降低内皮细胞中VEGF的活性来抑制血管生成，同时还能通过抑制Akt和ERK1/2信号通路来阻止细胞增殖[11][12][13]。此外，缺氧既是肢体缺血的核心病理特征，也是促进血管生成的主要诱因[13]。在之前的研究中，我们的团队利用GEO数据库中的GSE76739数据集的高通量测序数据进行了生物信息学分析，发现1%氧浓度环境下HUVECs的RGS4 mRNA表达显著升高。作为转录后调控因子，microRNA在调节与血管生成相关的基因表达中起着重要作用。早期研究已表明，miR-485-5p有助于维持内皮细胞对VEGFR信号的响应能力[14]。然而，目前关于miR-485-5p和RGS4在血管缺氧微环境中的功能作用的研究还十分有限。因此，本研究以下肢缺血模型为研究对象，旨在阐明miR-485-5p/RGS4轴影响血管生成的分子机制，为治疗缺血性血管疾病提供新的潜在靶点。

研究内容：细胞培养与处理：HUVECs来自中国科学院上海生命科学研究院的细胞资源中心。这些细胞在含10%胎牛血清（FBS；Absin，上海，中国）和1%青霉素-链霉素溶液（Beyotime，上海，中国）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco，加利福尼亚州卡尔斯巴德）中培养，培养条件为37℃、5%二氧化碳的湿润培养箱环境。缺氧状态是通过添加100 μM CoCl?来实现的。

结果1：缺氧条件下HUVECs中RGS4和miR-485-5p的表达发生改变。缺氧是促进血管生成的关键生理刺激，鉴于RGS4在调节血管稳态中的重要作用，我们想要了解其在缺氧条件下在内皮细胞中的表达是否会发生变化。在用于模拟缺氧的二价金属中，CoCl?已被证明能有效引发缺氧反应[15]，因此我们通过CoCl?处理建立了内皮细胞缺氧模型。我们使用CCK-8检测法评估了不同浓度CoCl?的处理效果。

结果2：抑制RGS4可增强HUVECs的增殖、迁移和管状结构形成能力。为探究RGS4在VEGFR-2信号通路中的调控作用，我们设计了三种针对RGS4的特异性siRNA，并通过西方印迹法验证了它们的敲低效率。所展示的数据为三组独立重复实验的结果（n=3）。与si-NC组相比，si-RGS4–3组的沉默效率最高（1.02±0.14 vs 0.39±0.10；p<0.01）（图2A-B），因此被选用于后续实验。我们还验证了……

结果3：过表达miR-485-5p可促进HUVECs的增殖、迁移和管状结构形成。为研究miR-485-5p在HUVECs血管生成中的作用，我们在常氧和缺氧条件下分别用miR-485-5p模拟物转染细胞，以实现其稳定过表达。我们通过RT-qPCR检测miR-485-5p的表达水平，以此评估其在常氧条件（1.02±0.03 vs 5.36±0.25；p<0.001）和缺氧条件（0.99±0.9 vs 3.4±0.32；p<0.001）下的转染效率（图3A）。CCK-8增殖检测结果显示，miR-485-5p过表达后……

结果4：miR-485-5p通过靶向RGS4来调控VEGFR-2、AKT和ERK1/2的磷酸化水平。鉴于在我们的缺氧模型中miR-485-5p和RGS4的表达模式相反，我们推测RGS4 mRNA基因是miR-485-5p的直接靶标。我们通过生物信息学分析预测了miR-485-5p的可能结合位点，在RGS4基因的3′非翻译区发现了一个潜在的结合位点（图4A）。为验证RGS4是否为miR-485-5p的直接靶标，我们进行了双荧光素酶报告基因实验。实验结果表明，转染后……

结果5：RGS4与VEGFR-2相互作用，并调控VEGFR-2、AKT和ERK1/2的磷酸化水平。在缺氧条件下，VEGFR-2信号通路的激活是推动血管生成的核心机制。我们通过西方印迹法检测了VEGFR-2、AKT和ERK1/2的磷酸化水平。如图5A-C所示，沉默RGS4会显著提高常氧和缺氧条件下VEGFR-2、AKT和ERK1/2的磷酸化水平，说明抑制RGS4能促进VEGFR-2信号通路的激活。为进一步研究具体机制……

结果6：过表达RGS4可减弱miR-485-5p对VEGFR-2信号通路以及内皮细胞增殖、迁移和管状结构形成功能的促血管生成效应。为研究RGS4在miR-485-5p诱导的内皮细胞增殖、迁移和管状结构形成过程中的作用，以及它对缺氧条件下VEGFR-2/AKT/ERK1/2信号通路的影响，我们在缺氧条件下将内皮细胞分别用miR-485-5p模拟物单独转染或与RGS4过表达质粒共同转染6小时。西方印迹法分析显示，RGS4过表达可部分抵消miR-485-5p对RGS4表达的抑制作用，从而提高RGS4的水平……

结果7：抑制RGS4可促进缺血大鼠的肢体血流恢复和血管生成。为探究RGS4在体内血管生成中的作用，我们首先建立了大鼠下肢缺血模型，然后分别通过尾静脉注射si-RGS4（75 nmol）和si-NC（75 nmol）。我们评估了该干预措施的全身安全性，结果显示si-RGS4组和si-NC组的血清肝肾功能指标（ALT、AST、BUN、肌酐）均无显著差异（补充数据S3）。我们还使用激光多普勒血流成像技术动态监测了……

结果8：miR-485-5p/RGS4轴通过VEGFR-2/AKT/ERK1/2信号通路调控血流恢复和血管生成。为进一步研究miR-485-5p在体内血管生成中的作用，在建立下肢缺血模型后，我们分别给模型大鼠注射磷酸盐缓冲液、agomir-miR-485-5p（75 nmol）或agomir-NC（75 nmol）。我们首先评估了干预的安全性，结果发现agomir-miR-485-5p组与agomir-NC组的血清肝肾功能指标均无显著变化，这说明该物质全身给药是安全的……

讨论：外周动脉疾病（PAD）是一种日益严重的全球健康问题，其病因是下肢动脉发生动脉粥样硬化阻塞，进而导致慢性组织缺血和严重的局部缺氧[18]。面对缺氧状况，血管系统会启动代偿性的血管生成反应，试图恢复血液灌注，但这种反应往往不足以阻止疾病的发展[19]。因此，揭示调控缺血后血管生成的分子机制具有重要意义……

作者贡献说明：李梦婷：写作——审稿与编辑、写作——初稿撰写、可视化、验证、软件应用、方法设计、研究实施、数据整理、概念构建。罗玉林：写作——审稿与编辑、可视化、验证、方法设计、数据整理、概念构建。李宇飞：验证、软件应用、项目管理、方法设计、研究实施、正式分析、数据整理。游静灿：可视化、软件应用、资源获取、方法设计、研究实施。王立群：写作——

患者出版同意书：不适用。

伦理审批与参与同意：所有动物实验均获得中国西南医科大学动物实验伦理委员会的批准，并在该委员会的监督下进行。

资金支持：本研究得到了中国国家自然科学基金（编号82370419、81800434）以及西南医科大学科学研究项目（编号2021ZKMS037）的支持。图表制作采用BioRender软件，?biorender.com。

利益冲突声明：作者声明在本文发表过程中不存在任何利益冲突。

李梦婷|罗玉林|李宇飞|游静灿|王立群|吴建波|郑有坤|罗茂