SARS-CoV-2核衣壳蛋白通过增强GRP75依赖的内质网与线粒体连接以及重编程肺泡巨噬细胞，从而引发肺部损伤

《Life Sciences》：SARS-CoV-2 nucleocapsid protein drives pulmonary injury by enhancing GRP75-dependent ER–mitochondria tethering and reprogramming of alveolar macrophages

　　摘要
目的：探讨SARS-CoV-2核衣壳蛋白（N蛋白）是否通过增强GRP75依赖的内质网与线粒体连接以及重编程肺泡巨噬细胞来引发肺损伤。

材料与方法：从小鼠肺组织中分离出肺泡巨噬细胞、内质网和线粒体。用重组N蛋白联合或单独使用慢病毒敲低GRP75来刺激骨髓来源的巨噬细胞及RAW264.7巨噬细胞。通过共聚焦成像、透射电子显微镜、邻近连接试验、共免疫沉淀及生化方法检测内质网与线粒体的相互作用、连接复合物的形成、线粒体钙离子动态及功能。在体内实验中，于气管内接种N蛋白前先在C57BL/6小鼠肺组织中敲低GRP75，随后评估肺损伤、巨噬细胞极化、线粒体功能及单细胞转录组变化。

主要发现：N蛋白促使GRP75重新分布到肺泡巨噬细胞中，且不会改变全肺组织中的GRP75总量。它增强了内质网与线粒体的接触，以及IP3R1–GRP75–VDAC1复合物的组装，从而导致线粒体钙离子过度积累、膜去极化、线粒体活性氧增加、ATP耗竭以及促炎细胞因子的产生。敲低GRP75可逆转这些异常，恢复线粒体功能并抑制炎症。在体内实验中，敲低肺组织中的GRP75可减轻N蛋白引发的肺损伤、炎症细胞浸润、细胞因子释放、巨噬细胞M1极化以及肺泡巨噬细胞的线粒体功能障碍。单细胞RNA测序进一步表明，敲低GRP75可通过减少促炎性的Car4+亚群并增加抗炎性的CD74+亚群，来逆转N蛋白引起的巨噬细胞转录重编程。

意义：这些研究证实，GRP75依赖的内质网与线粒体连接是N蛋白破坏巨噬细胞稳态并引发COVID-19相关肺损伤的关键机制，同时提示GRP75介导的肺泡巨噬细胞信号通路可能成为潜在的治疗靶点。

引言
由SARS-CoV-2感染引发的COVID-19初期常表现为轻微的上呼吸道症状，但很快可能发展为急性呼吸窘迫综合征，尤其在老年人或患有高血压、糖尿病、肥胖等基础疾病的人群中更为常见[1][2]。COVID-19相关的急性呼吸窘迫综合征（CARDS）的死亡率高达近50%，早期研究显示非死亡病例中该病的患病率超过90%[3]。在CARDS的初始阶段，病毒抗原和受损的上皮细胞会激活肺泡巨噬细胞，进而引发细胞因子和趋化因子的产生，这会促使免疫效应细胞聚集，使促炎反应升级为细胞因子风暴[4]。细胞因子的大量释放会进一步促进免疫细胞浸润，破坏肺泡-毛细血管屏障的完整性，导致肺液积聚、气体交换障碍，最终引发呼吸衰竭[5]。

SARS-CoV-2的基因组编码四种结构蛋白：刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白[6]。刺突蛋白通过受体结合和膜融合使病毒进入细胞。核衣壳蛋白通过与病毒RNA结合，促使核糖核蛋白复合物的形成，从而实现基因组的包装。膜蛋白通过与其他结构蛋白相互作用参与病毒的组装过程，而包膜蛋白则作为病毒孔道，控制宿主膜的通透性，并有助于病毒的组装和释放[7]。最新研究表明，即使在没有完整病毒的情况下，这四种结构蛋白中的每一种都可能独立引发肺损伤[8][9][10][11]。包括本团队在内的多项研究已证实，N蛋白可通过多种不同机制引发肺损伤，如补体激活、NOD样受体蛋白3炎性小体组装、晚期糖基化终产物受体途径激活以及NF-κB信号通路的活化[12][13][14][15]。

线粒体相关膜结构是内质网与线粒体之间距离约为10–30纳米的特化接触位点，它们将二者物理连接在一起[16]。多种连接机制可形成这类线粒体相关膜结构，其中IP3R1–GRP75–VDAC1复合物最为重要。该复合物由三种蛋白质组成：定位于内质网的肌醇1,4,5-三磷酸受体1、分子伴侣葡萄糖调节蛋白75，以及位于线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道1。GRP75作为桥梁蛋白，连接IP3R1与VDAC1，促进内质网向线粒体转移钙离子。线粒体相关膜结构内的这一钙离子信号传导轴对维持细胞稳态至关重要，可调控脂质代谢、自噬、凋亡、炎性小体激活以及线粒体分裂等多种生理过程[17]。近年来，线粒体相关膜结构完整性的破坏逐渐被认为与代谢性疾病、神经性疾病及炎症相关疾病的发病机制有关[18]。Arruda等人发现，肥胖会升高IP3R1和PACS-2等线粒体相关膜结构蛋白的水平，促进肝脏中内质网与线粒体的接触位点形成。这种更强的连接会导致线粒体钙离子超载并干扰葡萄糖代谢，而降低IP3R1和PACS-2的水平则可改善肥胖动物的线粒体功能及血糖控制[19]。除IP3R1–GRP75–VDAC1复合物外，还有其他多种蛋白质复合体也参与线粒体相关膜结构的形成。在帕金森病中，α-突触核蛋白会与内质网上的VAPB相互作用，干扰其与线粒体蛋白PTPIP51的结合，从而减少线粒体相关膜结构接触位点的数量。这种内质网与线粒体连接的丧失会损害钙离子信号传导及线粒体ATP的产生，增加多巴胺能神经元的脆弱性[20]。另一种内质网与线粒体连接的机制涉及内质网膜蛋白mitofusin 2，它能与线粒体膜上的mitofusin 1或Mfn2发生相互作用，从而在IP3刺激下促进线粒体高效摄取钙离子[21]。

在本研究中，我们旨在阐明线粒体相关膜结构在N蛋白诱导的急性肺损伤中的作用。首先，我们检测了N蛋白是否改变了线粒体相关膜结构中IP3R1、GRP75和VDAC1的水平，随后研究了它是否通过IP3R1–GRP75–VDAC1复合物增强内质网与线粒体的连接。接着，我们在体外分析了这种增强的内质网与线粒体连接对线粒体钙离子稳态、线粒体功能及炎症反应的影响。在体内实验中，我们研究了GRP75介导的线粒体相关膜结构信号通路对肺损伤、巨噬细胞极化及线粒体完整性的影响。最后，我们利用单细胞RNA测序技术探讨了N蛋白对肺泡巨噬细胞转录的重编程作用。综上，这些研究揭示了一条以GRP75为关键节点的内质网与线粒体信号通路，阐明N蛋白暴露如何导致肺泡巨噬细胞功能异常及肺部病理变化。

章节节选
N蛋白诱导肺损伤的小鼠模型
无内毒素重组N蛋白的制备方法参照我们实验室之前的报道[15]。所有动物实验方案均获得浙江大学医学院动物伦理委员会的批准。实验用小鼠为雄性C57BL/6品系，饲养在无菌条件下，购自上海斯莱克实验动物中心。小鼠到达后先在浙江大学实验动物中心的无菌动物设施中适应，环境温度处于受控状态。

N蛋白升高肺组织肺泡巨噬细胞中的GRP75水平
通过密度梯度超速离心法从小鼠肺组织中分离出肺泡巨噬细胞、线粒体和内质网（见图1A）。通过Western blot分析验证了各亚细胞组分的分离纯度（见图1B）。IP3R1、钙网蛋白和BAP31在肺泡巨噬细胞及内质网组分中均有检测到，但在线粒体组分中未出现。GRP75则存在于肺泡巨噬细胞和线粒体组分中，而内质网组分中不存在。钙网蓝蛋白则分布于这三种细胞组分中，包括线粒体组分。

讨论
我们的研究证实，SARS-CoV-2的N蛋白通过促进GRP75依赖的线粒体相关膜结构形成来引发肺损伤。增强的内质网与线粒体连接会导致钙离子从内质网向线粒体过度转移，进而引起线粒体钙离子积累。随之而来的线粒体去极化、ATP耗竭以及活性氧水平升高会促使促炎性巨噬细胞被激活。在体内，这些变化会引发肺组织损伤、肺泡巨噬细胞的线粒体功能障碍以及M1型巨噬细胞的比例上升。

缩写说明
ARDS：急性呼吸窘迫综合征
AM?：肺泡巨噬细胞
BOK：BCL-2卵巢杀伤因子
BMDMs：骨髓来源的巨噬细胞
BAL：支气管肺泡灌洗液
CLP：结肠系膜结扎穿刺术
Co-IP：共免疫沉淀
COVID-19：2019冠状病毒病
CARDS：COVID-19相关的急性呼吸窘迫综合征
DMEM：杜尔贝克改良伊格尔培养基
ER：内质网
ELISA：酶联免疫吸附试验
FBS：胎牛血清
FACS：荧光激活细胞分选
GO：基因本体论
GRP75：葡萄糖调节蛋白75

作者贡献声明
Zang Ruoxi：论文撰写——审稿与编辑、论文撰写——初稿、可视化分析、结果验证、研究监督、软件应用、项目管理、方法设计、实验实施、正式分析、数据整理、概念构思。
Ren Yichao：论文撰写——审稿与编辑、论文撰写——初稿、可视化分析、结果验证、研究监督、软件应用、项目管理、方法设计、实验实施、正式分析、数据整理、概念构思。
Wang Jiangmei：论文撰写——审稿与编辑、论文撰写——初稿。

出版许可
无需特别许可。

伦理审批与参与同意
本研究中的动物实验方案已获得浙江大学医学院动物伦理委员会的批准。

资金支持
本研究得到了浙江省自然科学基金（LMS26H010003和LY24H010001）、国家自然科学基金（82272191和82370080）、浙江省卫生健康委员会（2024KY491和2025HY1325）、绍兴市卫生健康委员会（2023SKY103和2025SKY094）以及绍兴市自然科学基金（项目编号2024A14014）的资助。

利益冲突声明
所有作者均声明不存在任何潜在的利益冲突。

致谢
无。

作者名单：Zang Ruoxi | Ren Yichao | Wang Jiangmei | Le Zhenkai | Xia Jie | Huang Ruoqiong | Zheng Guoping | Qiu Guanguan | Qian Huifeng | Shu Qiang | Xu Jianguo