NR4A1负调控Erastin诱导的胰腺β细胞铁死亡

《Life Sciences》：NR4A1 negatively regulates ferroptosis of pancreatic β-cells induced by Erastin

　　

NR4A1负调控Erastin诱导的胰腺β细胞铁死亡。胰腺特异性敲除NR4A1（NR4A1）加重高脂饮食诱导的肥胖小鼠代谢紊乱。NR4A1敲除导致胰岛形态异常，并伴有高脂饮食喂养小鼠铁死亡增强。过表达NR4A1及其激动剂CsnB（Cytosporone B）可减轻Erastin在MIN6细胞中诱导的铁死亡。NR4A1与GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）蛋白丰度增加相关。

**论文解读：NR4A1负调控Erastin诱导的胰腺β细胞铁死亡**

**研究背景与问题**
2型糖尿病（T2D）以进行性胰腺β细胞功能障碍为核心病理特征，全球糖尿病患者中T2D占比超过90%，且中国患者数量持续增加、年轻化趋势明显，主要驱动因素包括肥胖、久坐和高热量饮食。β细胞损伤导致胰岛素分泌不足，进而引发高血糖及相关并发症（心血管疾病、糖尿病肾病、视力障碍等）。铁死亡是一种铁依赖性、伴随脂质过氧化物积累的调节性细胞死亡方式，已被证实参与多种疾病（肿瘤、神经退行性疾病、缺血再灌注损伤）的病理过程。近期研究显示，高糖/高脂刺激可导致β细胞代谢紊乱和氧化还原失衡，增加铁死亡易感性，而靶向铁死亡可减轻T2D相关β细胞功能障碍。核受体4A1（NR4A1，又称Nur77/TR3）属于核受体4A亚家族，在氧化应激或内质网应激条件下表达升高，并可通过调控cbl-b、MKP7、WT1、SURVIVIN、GPX1等因子发挥β细胞保护作用。然而，NR4A1在β细胞铁死亡中的具体角色尚不明确。本研究旨在阐明NR4A1是否通过调控铁死亡通路保护胰腺β细胞，为T2D治疗提供新靶点。

**研究开展与结论**
研究人员利用胰腺特异性NR4A1基因敲除小鼠（NR4A1-cKO）和MIN6细胞系，结合高脂饮食（HFD）喂养、铁死亡诱导剂Erastin和RSL3、NR4A1激动剂CsnB及铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）等工具，系统探究NR4A1对β细胞铁死亡的影响。结果表明，NR4A1缺失导致HFD诱导的肥胖小鼠出现更严重的代谢紊乱、胰岛形态异常（α细胞比例升高、β细胞比例降低）及铁死亡标志物（Fe2?、丙二醛MDA升高，谷胱甘肽GSH降低）增强。在体外，Erastin处理MIN6细胞可诱导铁死亡并上调NR4A1表达；过表达NR4A1或使用其激动剂CsnB能显著抑制Erastin诱导的铁死亡，表现为细胞活力恢复、铁离子和脂质过氧化物减少、GSH水平回升，同时铁死亡抑制蛋白GPX4和xCT表达上调。值得注意的是，NR4A1对GPX4的调控发生在翻译后水平（mRNA无显著变化，蛋白丰度增加）。该研究揭示了NR4A1作为β细胞铁死亡负调控因子的新功能，为理解T2D中β细胞保护机制提供了重要视角，并提示NR4A1及其激动剂可能成为防治T2D的潜在策略。论文发表在《Life Sciences》。

**主要关键技术方法**
1. **动物模型**：基于C57BL/6J背景，通过定向繁殖构建胰腺特异性NR4A1基因敲除小鼠（NR4A1-cKO），由Cyagen Biosciences构建。
2. **细胞模型**：MIN6细胞（小鼠胰岛素瘤细胞，源自山东第二医科大学王毅教授课题组），通过慢病毒感染构建稳定过表达NR4A1的OV细胞系。
3. **铁死亡诱导与调控**：使用Erastin（System Xc?抑制剂）和RSL3（GPX4直接抑制剂）诱导铁死亡；CsnB作为NR4A1激动剂；Fer-1作为铁死亡抑制剂。
4. **检测指标**：细胞活力（CCK-8）、活性氧（H2DCFDA探针）、Fe2?含量（试剂盒）、MDA含量、GSH含量、Western blot（检测NR4A1、GPX4、xCT、COX2、ACSL4、GCLC）、RT-qPCR（检测mRNA）、免疫荧光（定位GPX4、胰岛素、胰高血糖素）、TUNEL（检测β细胞凋亡）。
5. **代谢评估**：葡萄糖耐量试验（GTT）、胰岛素耐量试验（ITT）、胰岛素含量（ELISA）。
6. **统计分析**：至少三次独立生物学重复，数据以均值±标准差表示，两组比较用t检验，多组比较用单因素方差分析（ANOVA）加Dunnett多重比较检验，P<0.05为显著。

**研究结果**
**3.1 NR4A1敲除导致HFD诱导小鼠代谢紊乱**
在正常饮食下，NR4A1-cKO小鼠与flox小鼠体重和空腹血糖无差异，但血清胰岛素显著降低。高脂喂养12周后，cKO小鼠体重增长、摄食量和饮水量均显著高于flox小鼠；空腹血糖升高（约7 vs 5 mmol/L），胰岛素水平进一步降低；葡萄糖耐量和胰岛素敏感性均显著恶化，表明NR4A1缺失加剧肥胖相关的糖代谢异常。

**3.2 NR4A1敲除导致胰岛形态异常和铁死亡**
高脂喂养4个月后，cKO小鼠胰岛体积增大，α细胞比例升高，β细胞比例降低，α/β细胞比值升高。ROS染色显示cKO小鼠胰岛ROS水平升高；胰腺组织Fe2?和MDA含量显著升高，GSH含量降低，提示铁死亡激活。TUNEL/胰岛素/DAPI三重染色显示cKO小鼠β细胞中TUNEL阳性信号增多，表明β细胞凋亡增强。

**3.3 铁死亡诱导剂Erastin促进MIN6细胞铁死亡并上调NR4A1表达**
Erastin处理MIN6细胞呈浓度和时间依赖性降低细胞活力，增加ROS、Fe2?和MDA，降低GSH；Western blot显示铁死亡抑制蛋白GPX4和xCT表达下降，铁死亡标志物COX2和ACSL4表达上升，同时NR4A1蛋白表达显著升高。RSL3处理也得到类似结果，证实NR4A1广泛参与铁死亡调控。

**3.4 NR4A1过表达抑制Erastin诱导的MIN6细胞铁死亡**
稳定过表达NR4A1的OV细胞在Erastin处理后，细胞活力显著高于NC细胞；Fe2?和MDA含量降低，GSH含量升高；GPX4蛋白表达上调，COX2和ACSL4表达下调。RSL3处理下，GPX4上调、ACSL4下调，但xCT和COX2变化不显著，提示NR4A1主要通过调节GPX4抑制铁死亡。

**3.5 NR4A1激动剂CsnB抑制Erastin诱导的MIN6细胞铁死亡**
CsnB与Erastin共处理可恢复细胞活力，降低ROS、Fe2?和MDA，升高GSH；Western blot显示GPX4和xCT蛋白表达上调。加入铁死亡抑制剂Fer-1可进一步增强CsnB的效应，表明激活NR4A1转录活性可有效抑制β细胞铁死亡。

**3.6 NR4A1与GPX4蛋白丰度增加相关**
在OV细胞中，GPX4和xCT的mRNA水平无显著变化，但蛋白水平显著升高；在cKO小鼠胰岛中，GPX4蛋白表达显著低于flox小鼠。免疫荧光显示，无论正常饮食还是高脂饮食，cKO小鼠β细胞中GPX4荧光强度均低于flox小鼠。这些结果提示NR4A1在翻译后水平上调GPX4蛋白丰度，从而抑制铁死亡。

**讨论与结论**
讨论部分指出，NR4A1在多种应激条件下快速激活，是细胞增殖、凋亡、自噬、炎症和代谢的关键调节因子。本研究首次在胰腺β细胞中证实NR4A1负调控铁死亡，与肿瘤中NR4A1促进铁死亡的作用相反，体现了细胞特异性和组织差异性。机制上，NR4A1通过上调GPX4蛋白（而非mRNA）水平发挥保护作用，可能涉及翻译后修饰（如蛋白合成、折叠、稳定性或降解）。研究还提及与二硫化物凋亡（disulfidptosis）的潜在交叉调控，但限于β细胞模型，需进一步验证。
**研究结论**：NR4A1通过增加GPX4蛋白丰度负调控Erastin诱导的胰腺β细胞铁死亡，保护β细胞免受铁死亡损伤，为T2D治疗提供了新靶点。