化学蛋白质组学发现的一种具有脑渗透性的共价NLRP3抑制剂，其结合一个新的变构袋

《British Journal of Pharmacology》：Chemoproteomic discovery of a brain-penetrant, covalent NLRP3 inhibitor that binds a novel allosteric pocket

　　

背景与目的：NLRP3炎症小体是多种炎症性疾病的理想治疗靶点。尽管已有抑制剂被开发，但其化学多样性有限，且不具备理想的脑渗透性，而这对于治疗神经炎症性疾病至关重要。实验方法：研究人员应用化学蛋白质组学平台，筛选其亲电片段库以鉴定NLRP3抑制剂。研究人员重点关注与Cys463结合的化合物，因为该残基被确认为NLRP3功能的变构传感器。关键结果：发现了一个新型抑制剂系列，其带有丁炔酰胺亲电基团和独特的螺环内酰胺核心。该系列化合物表现出中纳摩尔级效力，并以Cys463依赖性方式抑制IL-1β分泌。冷冻电镜（cryo-EM）结构显示，配体与Cys463的结合稳定了无活性构象，从而阻止了炎症小体激活所需的结构重排。这些化合物具有理想的药代动力学性质，值得注意的是，其Kp,uu值>0.5，提示具有治疗神经炎症性疾病的潜力。给人源化小鼠施用代表性化合物，导致明确的NLRP3 Cys463靶点结合，并显著抑制LPS和ATP诱导的IL-1β分泌，在体内提供了明确的概念验证。结论与意义：基于化学蛋白质组学的配体发现本质上具有功能无关性，并有可能在已被充分表征的蛋白质靶点上发现新口袋。在此，针对NLRP3 Cys463在一个先前未表征的变构口袋内的配体优化，产生了一个独特且强效的抑制剂系列，其具有理想的物理化学和药代动力学性质，可用于治疗涉及中枢和外周组织中异常先天免疫激活的疾病。

**论文解读：化学蛋白质组学引导的脑渗透性共价NLRP3变构抑制剂的发现与优化**

**一、研究背景与问题**

NLRP3（NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3）炎症小体是先天免疫系统的关键组分，其异常激活与多种自身免疫性疾病、代谢性疾病和神经炎症性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病）密切相关。尽管NLRP3已成为极具吸引力的药物靶点，但目前尚无任何NLRP3抑制剂获得美国食品药品监督管理局（FDA）或欧洲药品管理局（EMA）的批准。现有抑制剂（如MCC950）虽在临床前模型中有效，但因肝毒性等问题在II期临床试验中失败，且其化学多样性有限，缺乏理想的脑渗透性，难以满足治疗神经炎症性疾病的需求。因此，开发具有新型化学骨架、独特作用机制且具备脑渗透能力的NLRP3抑制剂具有重要的临床意义。

**二、研究目的与主要发现**

本研究旨在通过化学蛋白质组学方法发现并优化一类新型共价NLRP3抑制剂。研究人员从亲电片段库中筛选出与NLRP3 Cys463残基结合的化合物，经结构优化得到一系列具有螺环内酰胺核心和丁炔酰胺亲电基团的强效抑制剂。这些化合物在纳摩尔浓度下抑制IL-1β分泌，其作用依赖于Cys463的共价修饰。冷冻电镜（cryo-EM）结构解析揭示了配体结合Cys463后稳定NLRP3无活性构象的变构抑制机制。代表性化合物在人源化小鼠模型中展现出良好的脑渗透性（Kp,uu > 0.5）和体内靶点结合，显著抑制LPS/ATP诱导的IL-1β释放，为治疗神经炎症性疾病提供了概念验证。该研究发表于《British Journal of Pharmacology》。

**三、主要关键技术方法**

1. **化学蛋白质组学靶点结合实验**：在OCI-AML2细胞裂解液或活细胞中，使用竞争性碘乙酰胺（IA）探针检测化合物对NLRP3 Cys463的共价靶点结合（TE₅₀），并通过全局数据非依赖性采集（DIA）蛋白质组学评估选择性（P₅₀₀）。
2. **体外炎症小体激活实验**：使用人外周血单核细胞（PBMCs）、PMA分化的THP-1细胞、人全血以及NLRP3^C463A突变的THP-1细胞，经LPS启动和尼日霉素（Nigericin）刺激后，通过ELISA检测IL-1β分泌，利用CellTiter-Glo测定细胞活力，并通过ASC-GFP报告细胞检测ASC斑点形成。
3. **单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）结构解析**：在重组表达的人源ΔPYD-NLRP3六聚体与VVD-338908共孵育后，进行冷冻电镜数据采集和三维重构，获得3.03 ?分辨率的NACHT结构域图谱，解析配体结合口袋及抑制机制。
4. **体内药代动力学与药效学评价**：在CD-1小鼠和人源化NLRP3小鼠（由北卡罗来纳大学教堂山分校Koller实验室构建）中，经皮下给药后测定血浆和脑组织药物浓度，计算Kp、Kp,uu值，并通过LPS/ATP诱导的腹膜炎模型检测IL-1β和IL-6水平。
5. **计算机辅助构象分析**：使用LigPrep、ConfGen和MacroModel软件对化合物进行构象生成和能量计算，评估刚性化策略对结合构象的影响。
6. **生物分析**：血液和脑组织样本经蛋白沉淀后，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定化合物浓度。

**四、研究结果**

**3.1 NLRP3 Cys463的功能潜力**
通过靶向化学蛋白质组学，研究人员发现MCC950在非共价结合时导致Cys280探针标记丢失，且Cys280与Cys463的探针标记抑制高度相关（Pearson相关系数显著），提示Cys463配体可能通过变构机制诱导类似MCC950的抑制构象。从超过300个候选化合物中筛选出丙烯酰胺类化合物VVD-124476，但其高脱靶反应性不适合细胞功能研究。

**3.2 靶向NLRP3的共价配体构效关系**
通过系统优化，将丙烯酰胺替换为丁炔酰胺亲电基团显著提高选择性（P₅₀₀从20.5%降至1.0%）；将氮杂环丁烷核心扩大为吡咯烷环恢复效力；进一步将酰胺环化至吡咯烷的2-位形成螺环内酰胺（VVD-162466），通过刚性化限制构象自由度，使靶点结合效力（TE₅₀）提升至0.75 μM，同时保持低脱靶活性（P₅₀₀=3.6%）。引入芳基格氏试剂加成或吗啉基修饰进一步优化效力，获得VVD-338213（TE₅₀=0.16 μM）和VVD-336673（TE₅₀=0.31 μM）。

**3.3 VVD-338213的体外活性**
VVD-338213在20 μM下对约10,000个半胱氨酸残基的全局蛋白质组学分析显示，NLRP3 Cys463是其主要靶点。在人PBMCs中，VVD-338213以Cys463依赖性方式抑制IL-1β释放（IC₅₀与靶点结合效力高度相关），并抑制ASC斑点形成。在NLRP3^C463A THP-1细胞中，VVD-338213的抑制活性完全丧失，而MCC950仍有效，确证其作用依赖于Cys463共价修饰。在人全血中，VVD-338213抑制IL-1β的IC₅₀（0.288 μM）优于MCC950（0.795 μM）。

**3.4 配体结合NLRP3的结构揭示新型抑制机制**
冷冻电镜结构显示，VVD-338908共价结合于Cys463，位于一个完全疏水的变构口袋（由Leu447、Leu451、Leu469、Leu507、Phe502、Phe529、Met532组成），该口袋在未结合时体积为82.8 ?³，结合后扩大至190.7 ?³，符合诱导契合模型。与活性NLRP3盘状结构对比表明，VVD-338908通过占据Phe502和Leu507的原始位置，阻止FISNA和NBD结构域发生87°旋转，从而稳定无活性构象，阻止从无活性六聚体向活性盘状结构的转变，发挥“分子门挡”作用。

**3.5 VVD-172957与VVD-175938的系统性及中枢神经系统药代动力学比较**
选定具有良好CNS多参数优化（MPO）评分的螺环内酰胺化合物进行脑渗透性评价。VVD-172957表现出更高的水溶性（17.5 μM）、更低的外排比（0.93）和更高的血浆暴露（Cmax=452 ng·mL^-1，AUC=404 ng·h·mL^-1），脑暴露也显著更高（Cmax=517 ng·g^-1，AUC=528 ng·h·g^-1）。两者Kp,uu值分别为0.66和0.70，均超过公认的0.3阈值，提示该系列化合物具有显著的脑渗透潜力。

**3.6 VVD-338213在体内有效抑制NLRP3活性**
在人源化NLRP3小鼠中，VVD-338213（50 mg·kg^-1 s.c.）在血浆中达峰浓度4446 ng·mL^-1，脑浓度达血浆的45.5%（2262 ng·mL^-1），而MCC950脑暴露仅为血浆的1%。蛋白质组学分析显示脾脏中NLRP3 Cys463靶点结合达86%。在LPS/ATP诱导的腹膜炎模型中，VVD-338213显著抑制腹腔灌洗液中IL-1β水平，效果与MCC950相当，并引起IL-6水平统计学显著下降。

**五、讨论与结论**

讨论部分指出，NLRP3是炎症小体激活通路的关键节点，但现有抑制剂缺乏脑渗透性且毒性问题突出。本研究通过化学蛋白质组学引导的发现流程，首次鉴定出结合Cys463变构口袋的新型共价抑制剂，其作用机制与MCC950完全不同。该系列抑制剂通过“分子门挡”机制稳定NLRP3无活性构象，且具有理想的脑渗透性，为治疗神经炎症性疾病提供了新策略。研究结论为：基于化学蛋白质组学的配体发现策略能够识别先前未表征的蛋白质功能口袋；针对NLRP3 Cys463的优化产生了一类新型共价抑制剂，具有独特的物理化学和药代动力学性质，可用于治疗涉及中枢和外周组织异常先天免疫激活的疾病。