在青鳉鱼中，生命周期内接触环境中的吡硫酮铜会导致多代间的发育和生殖毒性

《Marine Pollution Bulletin》：Life-cycle exposure to environmental copper pyrithione causes multigenerational developmental and reproductive toxicity in medaka

　　

• •
  铜吡硫酮会导致青鳉出现可遗传的发育和繁殖缺陷。
• •
  即使停止接触，多代影响仍会持续存在。
• •
  F1和F2代幼鱼受损更为严重，其中F2代的畸形程度最重。
• •
  观察到的缺陷包括存活率降低、脊椎弯曲以及孵化成功率下降。
• •
  铜吡硫酮的长期环境风险很可能被低估了。

引言

原本为减轻生物污损带来的运营和经济负担而研发的防污生物杀灭剂，如今已普遍污染水生生态系统，这对非目标生物及生态平衡构成了严重威胁（de Campos等人，2022；Kristensen等人，2008）。虽然三丁基锡曾是主流防污剂，但由于其被全球禁用，人们开始使用替代化合物，但这些替代物的环境风险尚未得到充分研究（de Campos等人，2022；Sonak等人，2009；Martins等人，2018）。

铜吡硫酮是由吡硫酮与铜离子结合形成的螯合物，如今已成为现代防污涂层中常用的增效生物杀灭剂。它之所以被广泛应用，是因为具有广谱抗菌性、水溶性低，且被认为环境危害较小，还能较快光解（Yamada，2007）。然而，铜吡硫酮会逐渐从防污涂料中渗入水生环境，在水柱和沉积物中都有被发现，这引发了人们对其可能对水生生态系统造成影响的担忧（Takahashi，2009；Harino等人，2007）。有研究显示，沿海水域和港口中的铜吡硫酮浓度在0.01到5.6微克/升之间，其中某个码头检测到的最高浓度甚至达40微克/升（Mackie等人，2004；Tang等人，2024）。这些数据表明，铜吡硫酮在水生环境中会长期存在，从而带来潜在的生态风险。

越来越多的证据表明，铜吡硫酮会对多种水生生物造成急性和慢性毒性，包括微生物、藻类、无脊椎动物和鱼类（Tang等人，2024）。在无脊椎动物中，铜吡硫酮的急性毒性很强，对于玩具虾Heptacarpus futilirostris而言，其半致死浓度低至2.5微克/升（Mochida等人，2006），还会引发氧化应激、组织病理损伤以及生长迟缓（Marcheselli等人，2010；T?e?ňáková等人，2020）。尤为重要的是，最近有一项针对海洋 mysid 类动物Neomysis awatschensis的研究表明，即便在未观察到明显效应的浓度下，连续三代暴露于铜吡硫酮也会导致F2代出现生长迟缓、进食减少、繁殖能力下降，同时乙酰胆碱酯酶活性也会受到抑制（Lee等人，2023）。这一发现首次证明了，即使在亚致死、符合环境实际浓度的条件下，铜吡硫酮也能在无脊椎动物模型中引发多代毒性效应。

在鱼类中，铜吡硫酮的发育和繁殖毒性也已有大量研究记载。斑马鱼(Danio rerio)的胚胎在暴露于8微克/升及以上浓度的铜吡硫酮后，会出现脊索扭曲、肌纤维紊乱、心包水肿以及孵化成功率下降等现象（Almond和Trombetta，2016；Almond和Trombetta，2017）。红点鱼(Fundulus heteroclitus)的幼鱼在暴露于2和4微克/升的铜吡硫酮环境中50天后，会出现脊椎畸形，如脊柱侧弯、驼背等，同时侧部肌肉还会出现炎症肿块（Mochida等人，2008）。橄榄比目鱼(Paralichthys olivaceus)的胚胎在暴露于100微克/升的铜吡硫酮后，超过80%的个体会出现心包水肿、背部弯曲以及尾鳍褶皱缺陷（Shin等人，2022）。虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的幼鱼在暴露于5微克/升的铜吡硫酮后，会出现显著的生长迟缓，与氧化应激和铜元素运输相关的基因表达也会发生改变（Bourdon等人，2023）。在繁殖方面，雄性孔雀鱼(Poecilia reticulata)在暴露于与环境浓度相近的铜吡硫酮降解产物后，睾酮水平会下降，精子生成能力受损，求偶和交配行为也会受到抑制，最终导致无法正常繁殖（Li等人，2019；Li等人，2021；Li等人，2022）。同样，斑马鱼在单独或混合暴露于铜吡硫酮后，卵黄蛋白水平会上升，睾丸会出现退化，鳃和肝脏组织也会出现病理变化（Günal等人，2022）。这些研究共同表明，铜吡硫酮及其降解产物会对多种物种的不同生命阶段的发育和繁殖产生严重不良影响。

尽管已有大量相关研究，但目前的研究大多仅采用单代暴露实验设计，实验时长通常只有几天到几周，这大大限制了研究结果的可靠性。值得注意的是，目前几乎还没有研究探讨在符合环境实际浓度的条件下，铜吡硫酮对水生动物造成的长期多代影响。Lee等人（2023）针对N. awatschensis的无脊椎动物研究是唯一的例外，也为我们提供了重要参考，证明即便未超过无可见效应浓度，铜吡硫酮也会在连续多代中引发表型逐渐恶化。至于鱼类这类具有更复杂生殖和发育生理结构的脊椎动物，在持续暴露于环境浓度水平的铜吡硫酮时是否也会出现类似的多代效应，目前还有待进一步研究。

青鳉(Oryzias latipes)是填补这一研究空白的理想模型。作为一种体型较小、特征明确、世代周期短且繁殖力高的鱼类，青鳉已被广泛用于水生毒理学和发育生物学研究（Ishikawa，2000；Padilla等人，2009；Chen等人，2026）。此前已有研究证明，青鳉对铜吡硫酮极为敏感，1微克/升的浓度就能在12小时内导致成年青鳉100%死亡（Ohji和Harino，2017）。更重要的是，铜吡硫酮的降解产物也会影响青鳉的孵化率和游泳行为，这进一步凸显了该物种在评估铜吡硫酮毒性方面的价值（Ohji和Harino，2017）。

在本研究中，我们让青鳉在整个生命周期内持续暴露于1微克/升的铜吡硫酮，以此评估其多代影响。虽然单一暴露浓度限制了我们建立剂量-反应关系的可能性，但这一浓度在生态学上具有重要意义，因为它与受污染的港口水域及沉积物孔隙水中检测到的铜吡硫酮浓度范围相当，也与Lee等人（2023）在无脊椎动物研究中使用的浓度相似。更为重要的是，这是首例在脊椎动物模型中报道铜吡硫酮的多代发育和繁殖毒性研究，为我们提供了新的表型证据，将无脊椎动物的研究结果延伸到了鱼类身上。虽然目前还缺乏机制层面的研究数据，但通过对多代个体的生存、生长、发育、繁殖能力以及后代质量等方面的全面表型分析，我们已经为评估长期铜吡硫酮暴露对鱼类种群的生态影响奠定了坚实基础。

我们假设，持续暴露于环境浓度水平的铜吡硫酮（1微克/升）会在青鳉的多个世代中引发逐步累积的发育和繁殖不良效应。本研究的具体目标是：（1）通过检测F0、F1和F2代个体的存活率、孵化情况、形态参数（如体长）以及形态异常发生率（如心包水肿、卵黄囊吸收不良、 swim bladder无法膨胀、骨骼畸形等），来评估铜吡硫酮对胚胎发育的多代影响；（2）考察从幼鱼到成鱼的整个生命周期内的存活率以及雌性成鱼的繁殖能力，进而评估铜吡硫酮的多代影响。通过将全生命周期暴露设计与多代研究框架相结合，本研究旨在更全面、更符合生态学实际地评估铜吡硫酮对鱼类种群的长期风险。

章节摘要

实验设计与生物学操作流程

本研究已获得汕头大学动物伦理委员会的批准（批准编号：202310008，批准日期：2023年6月8日）。大约60对青鳉配对在室温下的1升流动培养箱中饲养至少两周，培养箱内使用经过除氯处理的自来水，其pH值为7.4±0.2，溶解氧含量为6.8±0.4毫克/升，电导率为580±30微西/m，总硬度以碳酸钙计为120±10毫克/升，氨含量低于0.1毫克/升。在鱼类交配期间，培养箱内的光照时间为16小时光照、8小时黑暗

对胚胎存活率的多代影响

在全部三代中，溶剂对照组嘅胚胎存活率都很高（20天胚龄时为94.45%±3.85%），其存活曲线较为平稳，仅有极轻微的初期死亡率，在孵化前会有略微下降的趋势（见图2）。相比之下，暴露于铜吡硫酮的组别则出现了严重的、持续多代的胚胎死亡率上升现象。在直接暴露的F0代中，胚胎死亡率从11天胚龄开始上升，从第17天起差异就具有统计学意义。到第20天时，累计

讨论

本研究首次证明，长期、全生命周期暴露于环境浓度水平的铜吡硫酮（1微克/升）会引发发育和繁殖毒性，而且这种毒性会在F0、F1和F2三代中持续存在并逐渐加剧。此前的研究仅在单代暴露条件下观察到铜吡硫酮的发育毒性，但那些研究中的浓度要高得多，实验持续时间也较短（Almond和Trombetta，2016；Almond和Trombetta，2017）

结论

本研究表明，长期暴露于环境浓度水平的铜吡硫酮会在青鳉中引发严重的多代毒性，表现为存活率下降、生长迟缓、身体结构畸形以及繁殖失败。尤为关键的是，这些缺陷会随着世代的延续而愈发严重，其中F2代出现严重骨骼和颅面异常的概率最高。这些发现表明，仅依靠单代毒性测试是远远不够的

CRediT作者贡献说明

Sutapa Debi：撰写——初稿撰写、可视化处理、方法设计、实验实施、数据整理。 Can Tang：撰写——审阅与编辑、可视化处理、资源准备、实验实施。 Mingfeng Li：撰写——审阅与编辑、可视化处理、资源准备、实验实施。 Hongdong Fang：撰写——审阅与编辑、可视化处理、资源准备、实验实施。 Jiezhang Mo：撰写——初稿撰写、项目监督、项目管理、资金申请、数据整理、研究构思。 Wenhua Liu：撰写——

资助情况

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：42577313、42207318）、中国国家自然科学基金重点计划（编号：42230413）以及广东省重点研发计划（编号：2023TX07A311）的支持。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。

Sutapa Debi|Can Tang|Mingfeng Li|Hongdong Fang|Jiezhang Mo|Wenhua Liu