无细胞脂肪来源细胞外囊泡胶通过抑制engrailed-1表达改善增生性瘢痕

《Materials & Design》：Cell-free adipose extracellular vesicle glue ameliorates hypertrophic scars by suppressing engrailed-1 expression

　　

cfAEG是一种“即用型”自体细胞外囊泡（EV）丰富材料，无需细胞培养即可快速制备。cfAEG通过微小RNA（miRNA）靶向作用抑制engrailed-1（EN1）（瘢痕纤维化的关键驱动因子）。cfAEG在临床转化大动物模型中降低瘢痕隆起并改善胶原组织。

研究背景与目的

增生性瘢痕（HS）是皮肤修复异常导致的纤维增生性疾病，以成纤维细胞过度活化、细胞外基质异常沉积和组织进行性僵硬为特征，常引起功能障碍与外观问题。目前临床常用的病灶内糖皮质激素注射、激光和手术切除等疗法复发率高、长期疗效不稳定。近年研究发现，engrailed-1（EN1）阳性成纤维细胞是驱动瘢痕纤维化的关键促纤维化亚群，抑制EN1可促进无瘢痕愈合，但缺乏安全有效的体内调控手段。脂肪组织来源的细胞外囊泡（EV）具有抗纤维化潜力，但传统EV制备依赖体外细胞扩增和超速离心，产量低、成本高、难以临床转化。基于此，研究人员拟开发一种兼具生物活性、可注射性和临床可行性的脂肪来源无细胞材料，并验证其治疗HS的效果与机制。该研究发表于《Materials》。

研究方法与关键技术

研究人员采用临床人腹部脂肪组织，经机械乳化（60次）和300×g低速离心制备cfAEG；利用流变学测试、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、透射/扫描电镜（TEM/SEM）和免疫印迹（WB）表征材料及EV；建立兔耳和迷你猪HS模型，注射cfAEG、曲安奈德（TA）或基质血管组分（SVF）进行比较；体外分离人原代皮肤成纤维细胞和脂肪间充质干细胞，采用CCK-8、RT-qPCR、miRNA转染、双荧光素酶报告基因和免疫荧光等技术验证EV内吞、miRNA靶向EN1及下游纤维化标志物表达。样本来源包括人体腹部脂肪、新西兰兔耳瘢痕和迷你猪背部瘢痕组织。

研究结果

1. cfAEG的制备与表征

经机械乳化与低速离心可获得具有良好流动性和可注射性的凝胶态材料。流变学显示其在15–45°C稳定、具剪切变稀和可逆触变回复特性。60次乳化可得到大量形态完整、约100 nm、CD81/TSG101阳性的EV，EV浓度约9.8×10¹¹ particles/mL；模拟生理条件下7天残留率38.07±5.31%，结构稳定。

2. cfAEG抑制兔耳HS形成

在新西兰兔耳瘢痕模型中，cfAEG注射后瘢痕面积和隆起明显减小，温哥华瘢痕量表（VSS）评分最低；瘢痕隆起指数（SEI）在12周接近1，胶原纤维排列较对照组、盐水组和SVF组更规则有序，效果与TA相当。

3. 瘢痕相关标志物表达变化

免疫荧光显示cfAEG组α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原（COL-I）和III型胶原（COL-III）的平均荧光强度显著低于对照组、盐水组和SVF组，与TA组无显著差异。

4. EV中miRNA对EN1的调控

EV转录组测序检出73种miRNA，其中ocu-miR-151-3p、ocu-miR-193a-5p、ocu-miR-211-5p和ppa-miR-381预测靶向EN1。培养21天的成纤维细胞EN1表达上调；EV共培养可显著下调EN1。转染miR-151-3p和miR-193a-5p同样降低EN1表达；双荧光素酶报告实验证实miR-151-3p直接结合EN1 3′UTR。

5. EV内吞抑制成纤维细胞增殖和纤维化

PKH26标记和免疫荧光显示ME60来源EV可被成纤维细胞内吞；CCK-8显示EV处理3–7天显著抑制细胞增殖。与EV共培养的成纤维细胞EN1、α-SMA和COL-I表达下降，而去除EV的cfAEG（no EVs）无此作用，表明EV是cfAEG抗纤维化的关键功能成分。

6. 动物瘢痕组织EN1表达下调

兔耳瘢痕组织免疫荧光显示，cfAEG注射组EN1平均荧光强度显著低于其他组，与体外结果一致。

7. 大动物模型验证

在皮肤结构与人类相似的迷你猪背部瘢痕模型中，cfAEG组伤口收缩程度最佳、瘢痕面积最小，VSS评分最低；组织学显示更平滑的表皮、上皮钉和皮肤附属器（毛囊）再生，胶原纤维呈连续波浪状规则排列；EN1、α-SMA、COL-I和COL-III表达均显著降低，且未出现TA相关的皮肤萎缩等不良反应。

讨论与结论

讨论指出，cfAEG的核心创新在于采用机械乳化结合低速离心的最小化处理策略，保留了脂肪组织天然EV、脂质基质和旁分泌因子，避免细胞培养和超速离心，可在20–30分钟内从自体脂肪制备，具有良好的临床可转化性。机制上，cfAEG通过EV携带的miRNA（特别是miR-151-3p和miR-193a-5p）靶向EN1，抑制EN1阳性成纤维细胞的促纤维化活化，从而下调α-SMA和胶原合成。去除EV的组分不能重现抗纤维化效应，进一步证明EV为主要效应成分。安全性方面，兔和迷你猪瘢痕组织中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达在各组间无显著差异，且自体来源可降低免疫排斥风险。结论为：本研究提出一种从人脂肪组织经机械乳化和低速离心制备cfAEG的新方法，无需体外细胞扩增和超速离心即可获得大量大小均一、功能活跃的EV；在动物瘢痕模型中，cfAEG注射可抑制瘢痕增生、改善胶原排列、降低瘢痕相关标志物表达；机制涉及成纤维细胞内吞EV后抑制细胞增殖和纤维化产物生成；cfAEG有望成为治疗增生性瘢痕的有效、可行且临床适用的无细胞疗法。