综述：利用microRNA调控网络工程化小米的气候适应性与营养强化

《Stress Biology》：Harnessing microRNA regulatory networks for engineering climate resilience and nutritional enhancement in millets

　　

小米（millets）作为气候适应性营养谷物（nutri-cereals）日益受到推崇，能够在干旱、高温、盐碱和低投入农业条件下稳定生产并支持营养膳食。微小RNA（miRNAs）提供了一种强大的转录后调控层，通过靶向关键转录因子（TFs）和转运蛋白网络，调控胁迫信号传导、作物发育、营养稳态和籽粒灌浆。小米miRNA研究仍处于早期发展阶段。迄今为止，大多数研究主要集中在miRNA的鉴定和表达谱分析上，而严谨的功能表征和调控网络的机制解析仍然有限。此外，将miRNA动态变化与基因型（G）×环境（E）互作整合，特别是在田间相关胁迫条件下的研究，仍不充分。在本综述中，研究人员综合了主要谷类作物中报道的与胁迫和营养相关的miRNA，强调了保守的调控模块，并总结了与干旱、盐碱、籽粒品质和微量元素积累相关的新兴小米特异性候选miRNA。研究人员批判性地评估了方法学上的空白，如不完整的降解组（degradome）支持、不一致的表型分析和有限的籽粒离子组学（ionomics），这些限制了向育种的转化应用。最后，研究人员提出了一条实用路线图，该路线图结合了组织阶段分辨的miRNA图谱、利用降解组测序（degradome sequencing）、RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增（RLM-RACE）和报告基因检测进行靶标验证，以及功能干预平台如短串联靶标模拟（STTM）、人工miRNA（amiRNAs）和CRISPR介导的miRNA位点或靶位点编辑，所有这些都与标记辅助选择和基因组预测相结合。从描述性miRNA目录向实验验证的调控网络推进，将能够实现基于miRNA的育种和基因组编辑，培育气候智慧型、富含微量营养元素的小米品种。

**Review framework and literature-search strategy**
采用系统文献检索策略，于Web of Science、Scopus、PubMed、Google Scholar、ScienceDirect、SpringerLink、NCBI资源库、miRBase及其他植物小RNA数据库中识别小米（millets）中miRNA介导的气候适应性、养分利用效率和营养性状调控的相关研究。优先纳入小米特异性研究，特别是涉及miRNA鉴定、表达谱分析、预测或验证靶标、降解组（degradome）支持的切割证据或实验功能验证的工作。

**Climate-resilient properties of millets**
小米（millets）的紧凑株型、发达深根系、较厚细胞壁及较小叶面积等形态结构特征显著增强其胁迫耐受性。C₄光合途径通过高效碳固定、灵活生物量分配及减少单位叶面积水分损失，进一步促进耐热与缺水条件下的生存。不同小米物种（如珍珠粟、穇子、黍子等）在酸性或盐碱土壤、低降雨量及高辐射条件下均表现出适应性，例如珍珠粟在氧化土中产量较高，穇子与稗子具有强抗氧化防御能力，褐顶粟可在弱酸性或盐碱土壤中生长，黍子适应边际雨养系统，苔麸耐涝，福尼奥米耐贫瘠。穇子在低投入条件下出苗率和产量稳定性优于玉米和高粱。

**Nutritional benefits of millets**
小米（millets）作为天然无麸质营养谷物，富含碳水化合物、膳食纤维、蛋白质、必需氨基酸、矿物质、维生素及植物化学物。穇子以高钙含量著称，珍珠粟富含铁和锌，稗子含镁、磷及低血糖指数，福尼奥米含硫氨基酸（如甲硫氨酸和半胱氨酸），褐顶粟含高膳食纤维和镁。然而，矿物质的吸收受植酸、多酚等抗营养因子影响，加工方法（浸泡、发芽、发酵、脱壳、烹饪）可改变其生物可及性与生物利用率。膳食干预研究显示，穇子粥可改善学龄女童血红蛋白水平，多小米混合补充剂可改善学生人体测量指标，但需结合加工、膳食组成及人群背景综合解释。

**Current status of miRNA research in millets**
小米（millets）的miRNA研究仍处于早期快速发展阶段，集中于miRNA发现、计算靶标预测及胁迫条件下的差异表达谱分析。已鉴定多个保守miRNA家族与干旱、盐碱、高温、病原响应、根系发育、开花及营养途径相关，但仅少数研究从预测或表达谱推进至机制验证。关键挑战在于区分仅被检测、计算预测或表达相关的miRNA与有降解组证据、靶标验证、功能测定或性状水平确认的miRNA。

**Drought and heat stress**
利用in silico方法从五种小米基因组中鉴定出约84个保守miRNA，但需实验验证。miR394和miR396家族成员（如Sit-miR394、SimiR396d）在粟（foxtail millet）中通过调节根长正向调控干旱耐受性。珍珠粟（pearl millet）中鉴定出61个新型Pg-miRNAs，其中多个（如Pg-miR167、Pg-miR172、Pg-miR396、Pg-miR399）与根生理和非生物胁迫响应相关，但需降解组分析、RLM-RACE或功能验证确认。高粱（sorghum）中干旱、高温及复合胁迫下鉴定出80个miRNA和8个新型胁迫响应miRNA家族。

**Salinity stress**
珍珠粟中鉴定出95个盐胁迫响应miRNA（81个保守、14个新型），靶向448个调控生长素响应的基因，提示miRNA介导的生长素调控可能参与盐适应。穇子（finger millet）中Eco-miR169–EcNF-YA₁₃调控网络赋予盐与脱水胁迫耐受性，调节Eco-miR169可解除抑制并增强耐性。另一穇子研究中48个保守和35个新型盐胁迫响应miRNA（如miR160、miR162、miR169、miR894、miR2914）在耐盐基因型中上调超10倍，但需靶标和功能验证。

**Biotic stress**
高粱中鉴定出35个差异表达miRNA响应炭疽病；甘蔗花叶病毒研究中发现24个高粱源miRNA靶向病毒基因组，并调节宿主防御基因。粟中小RNA-seq分析鉴定出38个miRNA家族的432个潜在靶标，涉及发育、信号转导、代谢、抗病及环境胁迫响应。

**Plant growth and development**
miR156–SPL模块调控幼年到成年转变、分蘖、穗型及开花时间，在粟和高粱中保守。miR160、miR167、miR393通过靶向生长素响应因子（ARF）及受体调节侧根起始与伸长。SimiR396d通过靶向SiGRF1实验证实调控根长和生长。miR396靶向生长调节因子（GRF）控制叶大小和器官生长；miR319靶向TCP转录因子影响叶形、分蘖和光合能力。miR156与miR172互作（miR172下游）促进花转变，调节物候可塑性以适应多变降雨。

**miRNA-mediated regulation of nutritional and grain-quality traits**
珍珠粟中pgl-miR159被鉴定为与铁代谢相关的候选miRNA，但非功能验证。粟中全基因组miRNA分析预测出与淀粉生物合成基因和胚乳发育相关的候选miRNA。直接证据仍有限，需进一步验证miRNA–靶标模块。

**Integration of miRNA markers into marker-assisted breeding pipelines in millets**
miRNA标记（如基于保守前体序列的SSR、SNP）可捕获调控变异，直接关联耐逆性、发育可塑性和产量稳定性。粟中已开发66对引物，具有高跨属转移性。珍珠粟根miRNA表达谱（miR165、miR168、miR170、miR319等）揭示干旱耐受基因型中多样性更高，但需验证后用于育种。

**Role of miRNAs in plant growth and stress response**
miRNA通过调节激素信号（生长素、细胞分裂素、赤霉素）协调器官分化、根冠结构、叶形态及开花时间。胁迫下，miRNA作为分子开关靶向MYB、NAC、GRF等转录因子，调控氧化、硫酸盐、磷酸盐饥饿及干旱、盐碱、病原攻击等响应。

**miRNAs identified for stress responses in model plant (Arabidopsis)**
拟南芥中热胁迫诱导miR156上调，靶向SPL参与热记忆；miR160靶向ARF10/16/17调节种子萌发和热休克蛋白（HSP）表达；miR164上调增强长期耐热性；miR398通过靶向CSD1/CSD2和CCS赋予耐热性。冷胁迫中miR169/NF-YA、miR394（通过CBF通路）、miR397调节CBF/COR基因。干旱胁迫中miR172E通过GI依赖上调，靶向WRKY44调节糖信号和干旱逃逸；miR165/166介导HD-ZIP_III通过ABA信号调控耐旱性。盐胁迫中miR393通过RACK1A诱导负调控TIR1/AFB2及氧化还原组分；miR417负调控种子萌发。

**Role of miRNA in regulation of nutrient deficiency in plants**
氮缺乏下miR160上调、miR169下调，分别影响生长素信号和硝酸盐转运蛋白（AtNRT1.1、AtNRT2.1）。磷缺乏中miR827靶向NLA维持磷稳态，miR399作为韧皮部长距离信号维持Pi稳态。钾缺乏时miR408下调，过表达可增强K吸收、生物量和光合效率。

**miRNAs in grain development, yield, yield-associated parameters, and quality traits**
miR156过表达使拟南芥生物量增加超300%；miR408过表达增加叶面积、果荚长度和种子品质。水稻中osi-miR397过表达使粒重和产量增加25%；OsSPL14（miR156靶标）过表达增强穗分枝和产量；miR444a调节分蘖；miR1873和miR408也参与产量调控。粟中miRNA参与淀粉生物合成及水杨酸诱导的甲硫氨酸和叶酸代谢。

**Comparative insights into miRNA research in millets and major cereals**
小米miRNA研究虽扩展迅速，但仍落后于水稻、小麦、玉米等主要谷类作物。主要谷类作物中已实现过表达、敲除、STTM和CRISPR等广泛功能研究，而小米多集中于小RNA和降解组数据集。未来需扩展多组学整合以实现系统水平理解。

**Future prospects for miRNA research in millets**
未来需结合高通量小RNA测序、降解组分析、转录组、蛋白质组和代谢组，构建多层次miRNA图谱。系统鉴定小米特异性miRNA及其靶标，并利用降解组测序、RLM-RACE、PPM-RACE、qRT-PCR和报告基因检测进行实验验证。

**Building comprehensive miRNA atlases in millets**
构建高分辨率多因子miRNA图谱，覆盖干旱、高温、盐碱、低温及宏量/微量元素胁迫，采样根、茎、穗及籽粒灌浆组织，比较精英品种与地方品种。时间序列取样可识别早期“哨兵”miRNA，并表征籽粒特异性miRNA调控Fe/Zn再动员与装载。

**Climate-smart breeding driven by miRNA markers in millets**
miRNA标记（如基于SSR/SNP）具有高稳定性与跨属转移性，可与标记辅助选择（MAS）和基因组选择（GS）结合，加速培育耐逆、高产、营养强化的小米品种。

**Decoding stress-responsive miRNA target networks in millets**
核心调控模块（如miR156–SPL、miR169–NF-YA、miR393–TIR1、miR398–CSD、miR399–PHO2）协调热/干旱可塑性、根系结构、氧化胁迫和磷饥饿响应。整合离子组学和代谢组学可关联miRNA信号与抗氧化代谢物、渗透调节物质及矿质积累。

**Nutritional enrichment via miRNA engineering in millets**
需系统鉴定靶向营养转运蛋白（ZIP、YSL、IRT1/2、NRAMP、NAS）和种子储存成分的miRNA，并构建穗发育阶段特异性miRNA图谱。通过CRISPR编辑或miRNA辅助育种靶向调控植酸生物合成，可同时增强矿物质密度与生物利用率。

**Harnessing millet diversity and wild relatives for miRNA research**
利用粟、穇子、黍等地方品种和野生近缘种的基因组和泛基因组资源，结合小RNA和降解组图谱，可发现与耐逆性和营养品质相关的新型miRNA等位变异。全基因组重测序、miRNA profiling和GWAS/QTL定位可鉴定“丢失”或未充分利用的miRNA等位基因，并通过基因组选择将其渗入高产品种。

**Creating predictive models and digital miRNA twins in millets**
机器学习框架（如深度学习）可利用茎环结构、序列保守性和启动子特征预测胁迫响应miRNA。将miRNA调控层嵌入作物模拟平台，可建立“miRNA感知”模型，预测编辑miRNA在不同干旱、高温和贫瘠土壤下的表现。数字miRNA双胞胎可指导性状工程、辅助基因组选择并缩短育种周期。

**Translational pathways with miRNAs for climate resilient and nutrient dense millet cultivars**
多地点试验需比较编辑系与对照在干旱/高温管理下的籽粒Fe/Zn、品质和产量稳定性，并区分非转基因SDN-1/2与转基因SDN-3编辑。CRISPR/Cas敲除特定miRNA家族可验证靶标，优先设计结合早发性、持绿性和微量元素密集籽粒的型态。

**Role of CRISPR/Cas tools in millet miRNA research**
CRISPR可精确编辑miRNA前体、启动子和靶位点。水稻中编辑miR396位点于OsGRF4/8可增加粒重和抗虫性；小麦中编辑miR156 MRE于TaSPL13可改善粒数和穗型。编辑miRNA靶位点可实现可调的miRNA敏感性响应。

**Artificial miRNAs and target mimics for metabolic reprogramming**
人工miRNA（amiRNA）可实现基因特异性敲低，短串联靶标模拟（STTM）可隔离内源miRNA，解除靶基因抑制。在小米中，胚乳特异性表达amiRNA或MIM可富集Fe、Zn、Ca而避免营养生长权衡。

**High-throughput screening pipelines for millets**
利用狗尾草（Setaria viridis）模型进行快速构建-测试-学习循环，结合FoMV-VIGS瞬时筛选和CRISPR稳定转化，建立从amiRNA/MIM文库设计、原生质体验证、FoMV-VIGS筛选到稳定突变体多环境测试的流水线。最终将编辑株系与表型组和离子组学关联，筛选出保留农民偏好品质且增强气候适应性和微量元素密度的小米基因型。