骨髓Adipoq+细胞的年轻态由Cbfβ维持促进基于干细胞的骨修复

《Bone Research》：Youthfulness of marrow Adipoq+ cells maintained by Cbfβ facilitates stem cell-based bone repair

　　

研究人员发现骨髓Adipoq⁺细胞（BMACs）中的核心结合因子β（Cbfβ）对于维持骨骼干细胞和前体细胞（SSPCs）数量和功能至关重要。在BMACs中敲除Cbfβ（CKO）导致SSPC耗竭，包括骨膜群体，并损害小鼠双皮质骨折愈合。多组学（RNA-seq、CUT&Tag-seq和ATAC-seq）揭示Cbfβ通过维持DNA修复位点的染色质可及性，保持基因组稳定性，防止BMAC衰老，并减轻衰老相关分泌表型（SASP）。衰老细胞清除疗法减轻了BMAC衰老，恢复了SSPC群体，并改善了CKO小鼠的骨修复。在人类和小鼠中，Cbfβ表达随年龄增长而下降，伴随着BMAC衰老增加。AAV介导的Cbfβ过表达恢复了年龄相关的骨修复和SSPC下降。这些发现揭示了一种新机制，即BMAC中的Cbfβ通过衰老/SASP轴调节SSPC维持，为年龄相关的骨修复缺陷提供了潜在的治疗策略。

**论文解读：Cbfβ维持骨髓Adipoq⁺细胞年轻态促进基于干细胞的骨修复**

**研究背景与问题**
骨折延迟愈合和非愈合是老年人高残疾率和死亡率的主要原因。骨骼干细胞和前体细胞（SSPCs）的招募是骨折修复的关键，而老年个体中SSPC数量的显著下降是骨愈合受损的核心因素。然而，调控SSPC维持的上游信号来源及其驱动SSPC耗竭的机制尚不明确。骨髓脂肪组织随年龄增长而增加，并与骨愈合障碍相关，但骨髓脂肪细胞（BMACs）对SSPC调节的功能贡献仍不清楚。核心结合因子β（Cbfβ）是RUNX蛋白的共转录因子，参与骨骼发育和稳态，但其在BMACs中的作用尚未被探索。因此，研究人员开展本研究，旨在阐明BMACs是否通过Cbfβ依赖的信号调控SSPC维持和骨修复，以及相关分子机制。

**研究内容与结论**
研究人员利用Adipoq-Cre驱动Cbfβ条件敲除小鼠（CKO），发现Cbfβ在BMACs中的缺失导致SSPC耗竭（包括骨膜群体），并严重损害小鼠双皮质骨折愈合，造成骨不连。多组学分析（RNA-seq、CUT&Tag-seq、ATAC-seq）揭示Cbfβ通过维持DNA修复位点的染色质可及性，保护基因组稳定性，防止BMAC衰老，并减轻衰老相关分泌表型（SASP）。衰老细胞清除疗法（Dasatinib+Quercetin）可缓解BMAC衰老，恢复SSPC群体，并改善CKO小鼠的骨修复。在人类和老年小鼠中，Cbfβ表达随年龄增长而下降，伴随着BMAC衰老增加。AAV介导的Cbfβ过表达在中年小鼠中恢复SSPC丰度并促进骨愈合。这些发现表明，BMAC中的Cbfβ通过维持染色质可及性和基因组稳定性，防止BMAC衰老和SASP产生，从而以非细胞自主方式调控SSPC维持，为年龄相关骨修复缺陷提供潜在治疗策略。

**重要意义**
该研究鉴定BMAC衰老为一种先前未被认识的上游微环境机制，控制SSPC维持和骨折修复，并确立Cbfβ-BMAC轴作为骨骼再生的关键上游调节因子，为治疗年龄相关骨修复缺陷提供了新靶点。

**论文发表在《Bone Research》**

**主要关键技术方法**
1. 小鼠模型构建：利用Cbfbf/f与Adipoq-Cre杂交获得Cbfβ条件敲除小鼠（CKO），并引入tdTomato报告基因进行谱系追踪；构建诱导型Cbfβ CKO小鼠（Cbfbf/f;Adipoq-CreERT2）用于早期效应分析；采用AAV介导的Cbfβ过表达载体（AAV-Cbfβ）靶向BMACs。
2. 骨折模型：8周龄小鼠行股骨中段横断骨折，用25G针固定，于不同时间点收集样本进行组织学和μCT分析。
3. 多组学分析：对分选的BMACs进行RNA-seq（转录组）、CUT&Tag-seq（Cbfβ结合位点）和ATAC-seq（染色质可及性）分析，整合数据揭示Cbfβ调控的染色质和基因表达变化。
4. 细胞功能实验：从骨髓和骨膜分离间充质干细胞（MSCs），进行集落形成（CFU）检测、EdU增殖检测、流式细胞术分析SSPC亚群（如CD105-CD200+、PDGFRα+等）。
5. 条件培养基实验：收集Cbfβ缺失或对照BMACs（包括前体细胞和成熟脂肪细胞）的条件培养基，处理MSCs评估增殖和集落形成，并检测IGFBP7的作用。
6. 衰老细胞清除疗法：CKO小鼠口服Dasatinib+Quercetin（D+Q）清除衰老细胞，评估SSPC恢复和骨修复改善。
7. 人类样本分析：从年轻（21岁）和老年（91岁）男性供体获取骨髓脂肪组织，进行免疫组化和免疫荧光检测Cbfβ和衰老标志物。

**研究结果**
**Adipoq⁺ cells regulate fracture healing via Cbfβ-dependent signaling**
通过Western blot确认MSCs成脂分化过程中Cbfβ表达变化，构建Cbfβ CKO小鼠并验证敲除效率。股骨骨折模型显示，CKO小鼠软骨痂和矿化骨痂形成显著减少，骨不连比例增加，表明Cbfβ在BMACs中通过依赖信号调控骨修复。

**Cbfβ in Adipoq⁺ cell maintains SSPC populations**
CFU实验显示CKO小鼠骨髓和骨膜MSCs的集落形成能力显著下降，流式细胞术检测到CD105-CD200+、CD105+、PDGFRα+等SSPC亚群数量减少，且EdU标记显示增殖降低而非凋亡增加，表明Cbfβ缺失导致SSPC耗竭。

**Cbfβ deficiency in Adipoq⁺ cells reduces bone formation and promotes marrow adiposity and senescence**
μCT和组织学显示CKO小鼠骨形成减少（Osx+成骨细胞密度、MAR、BFR降低），血清P1NP降低；骨髓脂肪增加（OsO4 μCT和HE染色）；β-Gal和p21染色显示BMACs衰老增加，而外周脂肪和体重无变化，提示Cbfβ缺失特异性导致骨髓微环境改变。

**Cbfβ deficiency induces senescence in marrow Adipoq⁺ cells via DNA damage accumulation**
RNA-seq和GSEA分析显示衰老和SASP相关通路富集；EdU掺入减少，p21表达升高，β-Gal+细胞增加；γH2A.X和端粒相关DNA损伤灶（TAF）增加，表明Cbfβ缺失导致DNA损伤积累，驱动BMAC衰老。

**Cbfβ in Adipoq⁺ cells regulates bone formation and SSPCs via a non-cell-autonomous mechanism**
谱系追踪显示Adipoq⁺细胞在稳态和骨折修复中极少分化为成骨细胞；流式细胞术显示tdTomato阴性SSPCs在CKO小鼠中减少；条件培养基实验表明Cbfβ缺失的BMACs通过分泌IGFBP7抑制MSC增殖和IGF-AKT信号，且D+Q处理可逆转抑制作用，证明非细胞自主调节机制。

**Cbfβ preserves genome stability in BMACs through chromatin accessibility-dependent transcriptional regulation**
ATAC-seq显示Cbfβ缺失后染色质可及性大幅下降，RUNX基序富集在丢失的开放区域；CUT&Tag-seq显示Cbfβ结合在DNA修复和细胞周期相关基因（如Xrcc5、Mad2l2）的启动子区；ChIP-qPCR证实直接结合；短期敲除后染色质改变先于衰老出现，表明Cbfβ通过维持染色质开放保护基因组稳定性。

**Senolytic therapy rescued fracture healing defects and SSPC number in Cbfβ CKO mice**
D+Q处理减少CKO小鼠骨髓中β-Gal+衰老细胞，部分恢复SSPC亚群数量，并改善骨折愈合，且衰老BMAC丰度与SSPC数量呈负相关。

**Age-associated decline of Cbfβ in BMACs contributes to impaired skeletal regeneration**
人类和小鼠样本中，Cbfβ表达随年龄下降，γH2A.X+衰老脂肪细胞增加；AAV介导Cbfβ过表达在中年小鼠中增加SSPC数量并促进骨折愈合。

**总结与讨论**
本研究将BMAC衰老鉴定为一种先前未被认识的上游微环境机制，控制SSPC维持和骨折修复。通过保护染色质可及性和基因组稳定性，Cbfβ维护BMAC功能，并防止形成衰老、抑制性微环境。这些发现重新定义了骨髓脂肪谱系细胞作为骨骼再生的活跃调节因子，并提名Cbfβ-BMAC轴作为增强衰老过程中骨修复的有前景的治疗靶点。讨论部分指出，BMACs主要通过非细胞自主分泌机制调控SSPC，其中IGFBP7介导的IGF-AKT信号抑制是关键效应之一；但该研究也存在局限性，如Adipoq-Cre靶向范围宽泛、跨皮质血管信号机制待直接验证、IGFBP7并非唯一效应因子等。总之，该研究揭示了Cbfβ维持BMAC年轻态进而促进骨修复的新机制，为年龄相关骨修复缺陷提供了潜在治疗策略。