《New Biotechnology》：Refined Annexin V/PI Apoptosis Protocol to Minimize False-Positive Necrotic Cells
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程序性细胞死亡（PCD）是组织稳态以及清除受损或感染细胞所需的基本生物学过程。凋亡（apoptosis）是研究最深入的PCD类型之一，通常使用膜联蛋白V（Annexin V）/碘化丙啶（PI）检测进行评估。然而，常规的Annexin V/PI方案常因细胞收集和
程序性细胞死亡（PCD）是组织稳态以及清除受损或感染细胞所需的基本生物学过程。凋亡（apoptosis）是研究最深入的PCD类型之一，通常使用膜联蛋白V（Annexin V）/碘化丙啶（PI）检测进行评估。然而，常规的Annexin V/PI方案常因细胞收集和处理过程中造成的膜损伤而产生假阳性坏死信号。这种人为假象损害了坏死定量测量的计量准确性，限制了癌症研究中的检测标准化，并可能导致体外筛选中有前景的抗癌化合物被过早排除。为解决此问题，研究人员开发了一种改进的Annexin V/PI方案，旨在提高坏死检测的可靠性。在优化方法中，PI在细胞收集前直接添加到培养基中，仅允许膜完整性真正受损的细胞摄取PI。该策略有效减少了处理诱导的人为假象，并提供了对膜受损群体更准确的评估。精确区分凋亡细胞和坏死细胞对于标准化细胞检测以及准确解释药物诱导的细胞毒性效应至关重要。研究人员修订后的方案提高了凋亡评估的准确性、可重复性和稳健性，尤其在脆弱细胞系统中，同时与市售的Annexin V/PI检测试剂盒完全兼容。
**论文解读：改进的 Annexin V/PI 凋亡检测方案：减少假阳性坏死细胞的人为假象**
**研究背景与问题**
程序性细胞死亡（PCD）是维持组织稳态、清除受损或感染细胞的核心生物学过程，其异常与癌症、神经退行性疾病及自身免疫性疾病等多种病理状态密切相关。在众多PCD类型中，凋亡（apoptosis）是研究最广泛的一种，其特征包括细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）外翻、细胞皱缩、染色质凝聚及DNA片段化等。自1995年Vermes等建立Annexin V/PI流式细胞术检测方案以来，该法已成为区分凋亡细胞（Annexin V阳性/PI阴性）与坏死细胞（PI阳性）的“金标准”。然而，该标准方案在实际应用中存在一个关键缺陷：在细胞收集、洗涤、离心及重悬等操作过程中，部分原本健康的细胞因机械损伤导致细胞膜通透性增加，非特异性摄取PI，从而被错误地归类为坏死细胞。这种假阳性坏死信号在脆弱细胞系（如原代细胞、某些肿瘤细胞）中尤为突出，可导致坏死率高达50%以上，严重干扰药物细胞毒性效应的准确评估，并可能使有前景的候选化合物在体外筛选中被过早排除。因此，亟需一种简单、经济且不额外增加试剂耗材的改良方案，以消除操作损伤引入的假阳性，提高坏死定量的准确性。
**研究内容与结论**
本研究提出了一种改良的Annexin V/PI检测方案，核心改动在于：在细胞收集处理之前，直接将PI加入培养细胞的培养基中，孵育30 min，使PI仅被那些膜完整性已真正受损的细胞（即真正的坏死细胞）摄取。随后，在常规细胞收集流程（洗涤、消化、离心）之前，先将培养基中的PI洗去，从而避免后续操作中受损细胞对PI的重新摄取。该方案保留了所有标准试剂盒组分，无需额外试剂或设备，成本零增加。
研究人员选取了三种对操作敏感性不同的上皮细胞系进行验证：SK-LU-1（耐药性较强）、HEK-293T和H295R（均对操作敏感）。通过流式细胞术（FACS）比较改良方案与经典方案（即收集细胞后再加PI）的检测结果，发现：
- 在未经处理的细胞中，经典方案报告的坏死细胞比例显著高于改良方案，在SK-LU-1中约高2.6倍（24.3% vs 9%），在H295R中高达75% vs 15-22%，在HEK-293T中约50% vs <4%。
- 使用不同浓度的PI（2-16 μg/1.5 mL）染色，改良方案在所有浓度下均保持低坏死率，且无细胞毒性，而经典方案则始终产生高比例假阳性。
- 配对t检验显示，离心操作是导致假阳性PI摄取的主要步骤（p<0.0001），且离心速度（100-500 g）对改良方案无影响，但经典方案中无论速度高低均产生显著假阳性。
- 改良方案与商业化的LIVE/DEAD? Cell Imaging Kit在细胞活力检测上结果一致（无显著差异，p>0.05），证实了其准确性。
- 在顺铂（CDDP）诱导凋亡的实验中，两种方案均能检测到凋亡诱导效果，但经典方案始终报告更高比例的坏死/晚期凋亡细胞，包括在未处理对照组中，而改良方案更准确地反映了药物效应。
**结论与意义**
该改良方案通过简单调整PI添加时机，有效消除了因细胞处理操作引入的假阳性坏死信号，显著提高了坏死细胞定量的准确性、可重复性和稳健性，尤其适用于脆弱细胞系统。研究证明，该方案与所有市售Annexin V/PI检测试剂盒完全兼容，无需额外试剂或设备，成本中性，易于推广。该工作为药物筛选、细胞死亡机制研究提供了更可靠的技术手段，有助于避免因假阳性坏死误判而错失有前景的抗癌化合物。
**主要关键技术方法**
1. **流式细胞术（FACS）**：使用BD FACS Celesta流式细胞仪，通过检测PI（激发575 nm/发射610 nm）和FITC-Annexin V（激发488 nm/发射530 nm）进行细胞群体分析，未对形态异常细胞设门，以保留所有坏死/凋亡群体。
2. **细胞活力染色与计数**：采用改良PI预染法及商业LIVE/DEAD? Cell Imaging Kit（基于胞内酯酶活性与膜完整性）进行平行验证，通过C100自动细胞计数器及显微镜（10×）进行定量和成像比较。
3. **离心速度影响评估**：设置100、300、500 g三种离心力，检测PI阳性细胞比例变化及上清液吸光度（反映细胞损失），以独立验证离心操作对假阳性的影响。
4. **凋亡诱导实验**：使用顺铂（CDDP）处理SK-LU-1（100 μM）和H295R（150 μM）48 h，比较改良方案与经典方案对凋亡/坏死群体检测的差异。
**研究结果**
**1. 改良方案显著降低未经处理细胞的假阳性坏死率**
通过FACS直方图比较，未经处理的SK-LU-1细胞在改良方案中坏死细胞比例为9%（4 μg PI/1.5 mL），而经典方案为24.3%。随着PI浓度递增（2-16 μg），改良方案始终维持低坏死率，而经典方案坏死率显著升高。配对t检验显示，离心操作导致坏死细胞比例平均增加15.59%（p<0.0001）。
**2. 脆弱细胞系中改良方案优势更明显**
在H295R和HEK-293T细胞中，改良方案检测的坏死比例分别为15-22%和<4%，而经典方案分别升至约75%和50%。光镜观察与计数结果不一致，表明经典方案高估了坏死。
**3. 改良方案与商业试剂盒结果一致**
与LIVE/DEAD? Cell Imaging Kit比较，三种细胞系活力百分比无显著差异（SK-LU-1: 93% vs 90.75%；HEK-293T: 97.92% vs 97.08%；H295R: 91.07% vs 86.90%，p>0.05），且显微镜图像显示PI阳性仅见于形态塌陷的细胞。
**4. 离心速度不影响改良方案，但经典方案中假阳性与速度无关**
H295R细胞预染PI后，离心前、离心后（100-500 g）PI阳性率无显著变化；但离心后追加PI则导致阳性率显著增加（平均增加19-24%，p<0.01），且不依赖于离心速度。上清液吸光度表明低速离心导致更多细胞损失。
**5. 改良方案在顺铂诱导凋亡中保持准确性**
两种方案均检测到CDDP诱导的凋亡，但经典方案在SK-LU-1和H295R中报告的坏死/晚期凋亡细胞比例显著高于改良方案（坏死：SK-LU-1平均差异10.72%，H295R平均差异5.68%；晚期凋亡：SK-LU-1平均差异8.13%，H295R平均差异35.77%，p均<0.05）。改良方案更真实地反映了药物作用。
**讨论与结论**
讨论部分指出，经典方案中假阳性坏死的主要来源是细胞处理操作（尤其是离心、洗涤、重悬）造成的机械损伤，而非RNA结合等先前报道的其他因素。改良方案通过将PI添加点提前至细胞处理前，使PI仅标记真正坏死的细胞，之后洗去PI，从而避免后续操作中损伤细胞的非特异性标记。该方案的效果与细胞系对操作的敏感性正相关，在H295R、HEK-293T等脆弱系中尤为显著。此外，该方案与FACS及普通荧光细胞计数器均可兼容，且无需额外设门或特殊设备。
**研究结论**：研究人员提出了一种改良的Annexin V/PI凋亡检测方案，通过在细胞收集前直接向培养基中加入PI，有效消除了因细胞处理操作产生的假阳性坏死信号，显著提高了坏死细胞定量的准确性、可重复性和稳健性，尤其适用于脆弱细胞系统。该方案与所有市售试剂盒完全兼容，成本中性，易于实施，为标准化细胞凋亡检测和药物筛选提供了更可靠的工具。
